[发明专利]一种可表达VSV-G的重组毕赤酵母菌及其制备和应用

摘要

本发明涉及一种可表达VSV‑G的重组毕赤酵母菌及其制备和应用，重组毕赤酵母菌具有毕赤酵母菌KM71的形态、遗传和生理生化特征，且通过发酵能够表达VSV‑G。制备方法包括（1）采用PCR反应从质粒pLP/VSV‑G中克隆VSV‑G基因片段；（2）制备重组质粒pGM‑T‑VSV‑G；（3）制备重组质粒pPIC3.5K‑VSV‑G；（4）重组表达载体通过电转化法转化毕赤酵母KM71，利用组氨酸缺陷平板、遗传霉素平板及PCR筛选阳性重组子；（5）取阳性重组子进行培养诱导离心收集菌体并用酸性玻璃珠裂解。本发明采取的表达策略为胞内表达，有效消除了甲醇对细胞裂解液的污染。利用毕赤酵母表达系统制备VSV‑G蛋白，裂解液经过滤除菌后可直接用于细胞转染。为VSV‑G的大批量制备提供了基础，也对VSV‑G的研究及相应疾病治疗具有重要意义。

主权项

1.一种可表达VSV‑G的重组毕赤酵母菌的裂解液，其特征在于，能够促进哺乳动物细胞DNA转染，其中可表达VSV‑G的重组毕赤酵母菌的制备主要包括以下步骤：(1)采用PCR反应从质粒pLP/VSV‑G中克隆VSV‑G基因片段；(2)回收步骤(1)所得VSV‑G基因片段，并将所述VSV‑G基因片段与pGM‑T载体进行T‑A连接，转化入大肠杆菌Top10，扩增培养，酶切检测并测序，得到重组质粒pGM‑T‑VSV‑G，以获得EcoRI酶切位点；(3)利用EcoRI对步骤(2)所得pGM‑T‑VSV‑G酶切后得到VSV‑G片段，连入表达载体pPIC3.5K，转化入大肠杆菌Top10，扩增培养，酶切检测并测序，得到重组表达载体pPIC3.5K‑VSV‑G；(4)将步骤(3)所得重组表达载体pPIC3.5K‑VSV‑G通过电转化法转化毕赤酵母KM71，利用组氨酸缺陷平板、遗传霉素平板及PCR筛选，以阳性重组子；(5)取步骤(4)所得阳性重组子接种于BMGY液体培养基培养18‑24h,再转入BMMY培养基诱导培养96h，离心收集菌体并用酸性玻璃珠裂解，再利用Western Blot检测蛋白表达情况，确认VSV‑G蛋白的表达；将诱导后的可表达VSV‑G的重组毕赤酵母菌重悬于含有1mM PMSF的PBS中，加入等体积酸洗玻璃珠后，将混合物剧烈涡旋震荡1min，立即置于冰上1min；重复多次后混合物在4℃下离心收集上清，再用0.22μm滤膜过滤；再与pH5.4的等体积柠檬酸钠缓冲液室温孵育1min后保存使用。