[发明专利]一种基于富鸟嘌呤DNA敏化Tb3+荧光的microRNA检测方法

摘要

本发明公开了一种基于富鸟嘌呤DNA敏化Tb³⁺荧光的microRNA检测方法，属于光学生物传感技术领域。基于聚合酶Klenow片段和末端脱氧核苷酸转移酶的共同催化作用，将microRNA有效延伸成长度较长的富鸟嘌呤DNA序列，富鸟嘌呤DNA序列通过共振能量转移效应可增强Tb³⁺的荧光。Tb³⁺的荧光强度与microRNA浓度的对数成正比，据此实现microRNA的高灵敏检测。

主权项

一种基于富鸟嘌呤DNA敏化Tb³⁺荧光的microRNA检测方法，其特征在于步骤如下：（1）双聚合酶延伸富鸟嘌呤DNA序列：将模板DNA和microRNA与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液混合，在55 °C退火杂交10 min，冷却至室温后，加入聚合酶Klenow片段和脱氧三磷酸腺嘌呤核苷，在37 °C水浴中等温反应30 min，超滤除去过量的脱氧三磷酸腺嘌呤核苷后，向得到的溶液中加入含0.6 mM 脱氧三磷酸鸟嘌呤核苷、0.4 mM 脱氧三磷酸腺嘌呤核苷和 9 U末端脱氧核苷酸转移酶的三羟甲基氨基甲烷醋酸盐缓冲溶液，在37 °C水浴中等温反应2.5 h，生成富鸟嘌呤DNA序列；（2）荧光法检测microRNA浓度：将Tb³⁺加入到步骤（1）生成的富鸟嘌呤DNA序列溶液中，室温孵育10 min后，在光程为1 cm的石英池中、激发波长为290 nm、光谱扫描范围为450 nm‑610 nm的条件下，测量发射波长545 nm处的荧光光谱；microRNA浓度越大，生成的长的富鸟嘌呤DNA序列越多，富鸟嘌呤DNA序列与Tb³⁺相互作用发生的共振能量转移越强，Tb³⁺的荧光越强，根据Tb³⁺的荧光强度可实现microRNA的高灵敏检测。