[发明专利]检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA 的方法、试剂盒及其应用

摘要

本申请公开了检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方法，提取pgRNA后，使用RNase‑free Dnase I纯化提取的HBV pgRNA，采用qRT‑PCR的方法达到对pgRNA的定量检测，本申请还提供了检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的试剂盒。本申请，达到了如下效果：1)采用血液检测，无创，常规且可大规模应用；2)可检测血液中超低载量的PgRNA；4)该试剂盒及其在预测NA停药的应用可深入研究中国乙肝PgRNA形态，为开发PgRNA药物提供基础研究数据。给“乙肝临床指南十大待解决问题之一”的“寻找预测NA停药的临床标准及生物学标志”的问题解决提供了方案。

主权项

检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA的方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于，其包括如下实现步骤：样本处理：取外周血3‑5ml注入无菌收集管，室温放置；HBV pgRNA的提取:使用病毒RNA提取试剂盒，提取乙型肝炎患者血清或血浆中的HBV RNA，获得HBV RNA粗品；HBV pgRNA的纯化：使用使用RNase‑free Dnase I纯化提取的HBV pgRNA，包括如下步骤：1)建立如下反应体系：RNase‑Free DNase 10X反应缓冲液1ul；RNase‑Free DNase1ul/ug；RNA无核酸酶的水补足至10ul；将获得的HBV pgRNA粗品溶于洗脱液中，取1‑8ul加入如下反应体系中；2)37℃孵育半小时；3)加入1ul终止液终止反应；4)65℃孵育10分钟，使DNase失活，得到HBV pgRNA的纯品；pgRNA的定量检测：使用qRT‑PCR定量检测pgRNA，包括：如下步骤：1)配制qRT‑PCR反应体系，qRT‑PCR反应体系：PCR反应液12.5μL；引物探针混合液1.5ul；灭菌蒸馏水6μL；所述引物的上游引物包含如SEQ ID NO：3所示的碱基序列；下游引物包含如SEQ ID NO：6所示的碱基序列；所述探针，包含如SEQ ID NO：7所示的碱基序列；2)各反应管在漩涡振荡器上振荡30秒混匀，瞬时离心后按20μL/管分装至PCR仪样品反应管中待用；3)将HBV pgRNA纯品、阴性质控品、4个定量标准品用洗脱液溶解，各吸取5μL加入相应的PCR仪样品反应管中，盖上管盖并做好标记，用迷你离心机离心10秒，将管壁上的液体全部甩至管底，平稳放入仪器样品扩增槽；4)将振荡均匀的反应管置于qPCR仪中，根据相应的qPCR仪的使用说明，设置PCR热循环条件，完成qRT‑PCR反应；结果分析及判定：采用SPSS 21.0统计软件对结果进行分析。