[发明专利]一种利用CRISPR/Cas9技术基于SSA修复的基因无缝编辑方法

摘要

本发明主要属于基因编辑技术领域，具体涉及一种基因无缝编辑方法。该方法构建靶向CCR5和eGFP的CRISPR/Cas9表达载体CCR5.CRISPR/Cas9和eGFP.CRISPR/Cas9，并构建供体CCR5‑Donor载体；随后通过两次转染，利用CRISPR‑Cas9系统及细胞内的HR和SSA修复机制，通过细胞的嘌呤霉素和更昔洛韦正负向筛选，完成无缝编辑。

主权项

1.一种利用CRISPR/Cas9技术基于SSA修复的基因无缝编辑方法，其特征在于，所述基因无缝编辑方法首先构建靶向CCR5基因的CCR5.CRISPR/Cas9和靶向eGFP的eGFP.CRISPR/Cas9表达载体，所述CCR5基因的CCR5.CRISPR/Cas9和靶向eGFP的eGFP.CRISPR/Cas9表达载体的构建方法为：以pll3.7‑gRNA‑Cas9载体为模板，上游引物分别为CCR5‑F和eGFP‑F，下游引物都同为R，所述CCR5‑F的引物序列为：GACGGTCTCGGATCCCATACAGTCAGTATCAATTCGTTTTAGAGCTGTAGGATCCAAC，所述eGFP‑F的引物序列为：GACGGTCTCGGATCCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGATTTTAGAGCTGTAGGATCCAA；所述R的序列为：CAGCTCGAGAAAAAAAACACCGAATCGGTGCCA；分别PCR扩增CCR5和eGFP基因的gRNA片段；随后用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切CRISPR/Cas9表达载体，作为骨架，同时用BsaⅠ和XhoⅠ双酶切扩增获得的gRNA片段，对骨架和gRNA片段胶回收后，将酶切回收的骨架和PCR片段进行连接，连接体系中片段和骨架的摩尔数比为3:1，然后将连接产物转化感受态细菌DH5α，涂含氨苄青霉素的LB固体培养基的平板上，培养后挑取单克隆，继续培养，随后提取质粒，即获得所述CCR5.CRISPR/Cas9和eGFP.CRISPR/Cas9表达载体；并构建供体CCR5‑Donor载体，所述供体CCR5‑Donor载体具有pXL‑BACII‑Larm‑CAG‑TK‑PGK‑Puro^R‑T2A‑eGFP‑bGH pA‑R‑arm结构，其中，L‑arm和R‑arm为左右同源臂，L‑arm和R‑arm中间的CAG‑TK‑PGK‑Puro^R‑T2A‑eGFP‑bGH pA为筛选标记组件；所述供体CCR5‑Donor载体的构建方法为：用NotI和XhoI分别酶切载体pXL‑BACII‑R‑arm‑L‑arm及载体pBlue‑CAG‑TK‑PGK‑Puro^R‑T2A‑eGFP‑bGH pA，获得骨架和插入片段，连接构建，即获得所述载体CCR5‑Donor；所述pXL‑BACII‑R‑arm‑L‑arm的构建方法为：以HEK293T的基因组为模板，用引物SSA‑F：AATCTCGAGCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGTCTTACTGTCCCCTTCTGGG和SSA‑R：GTCGACTGTATGGAAAATGAGAGCTG扩增重复序列；同时用引物CCR5‑R‑F：TCATTTTCCATACAGTCGACTTAAAGATAGTCATCTTGGGGCTG和CCR5‑R‑R：AATAAGCTTCTCAAGAATCAGCAATTCTCTG，PCR扩增R‑arm‑P；以上述扩增的重复序列和R‑arm‑P为模板，用引物SSA‑F和CCR5‑R‑R扩增R‑arm，用HindIII和XhoI分别酶切pXL‑BACII‑L‑arm和R‑arm片段，分别作为骨架和片段，连接即获得所述载体pXL‑BACII‑R‑arm‑L‑arm；通过两次转染，利用CRISPR/Cas9技术分别打靶CCR5基因和eGFP靶位点以及利用细胞内的HR和SSA修复机制，通过细胞的正负向筛选，完成无缝编辑；所述两次转染中的第一次转染方式为：利用CCR5.CRISPR/Cas9表达载体和供体CCR5.Donor载体打靶CCR5基因，同时进行同源重组；第二次转染方式为：利用eGFP.CRISPR/Cas9表达载体打靶中间的筛选标记组件。