[发明专利]山梗菜的活性成分分析方法

摘要

山梗菜的活性成分分析方法，属于植物成分分析技术领域，包括七个步骤，步骤一、山梗菜总提物的制备，步骤二、山梗菜不同极性部位样品溶液的配制，步骤三、山梗菜总生物碱样品溶液的配制，步骤四、细胞株的培养，步骤五、MTT溶液的配制，步骤六、阳性对照药环磷酰胺的配制，步骤七、山梗菜中抗肿瘤活性的测定。本发明对山梗菜进行系统的分析，从中找出抗肿瘤成分，以便于更好的服务人类健康，对人类的健康做出了更大的贡献。

主权项

山梗菜的活性成分分析方法，其特征是：包括以下步骤，步骤一、山梗菜总提物的制备取山梗菜全草3.6kg，进行粉碎，获得粒径为20目的粉末，采用18倍量的浓度为95％的乙醇进行两次回流提取，采用18倍量的浓度为70％的乙醇进行一次回流提取，每次回流提取的时间均为2小时；提取结束后，进行过滤，并将三次提取的乙醇液合并回收溶剂，干燥后获得浸膏；步骤二、山梗菜不同极性部位样品溶液的配制取所述步骤一获得的浸膏，悬浮与水中，向其中依次加入石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，获得石油醚层干膏、氯仿层干膏、乙酸乙酯层干膏、正丁醇层干膏以及水层干膏；称取山梗菜石油醚层干膏、乙酸乙酯层干膏、氯仿层干膏以及正丁醇层干膏各1.00mg，采用无血清的RPMI‑1640培养基，溶解稀释至1mg/ml，过半径为0.45μm的滤膜后分别稀释，配制成终浓度分别为100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml的样品溶液；步骤三、山梗菜总生物碱样品溶液的配制取山梗菜氯仿层干膏1.00g,进行过滤和蒸干后，获得干膏，将获得的干膏溶于浓度为20％的甲醇中，过滤后取滤液；用Z60‑C₁₈HCE柱对滤液进行固相萃取，收集甲醇流份，蒸干，获得总生物碱干膏；精密称取总生物碱干膏1.00mg，采用无血清的RPMI‑1640培养基溶解稀释至1mg/ml，过半径为0.45μm的滤膜后分别稀释，配制成终浓度分别为100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml的样品溶液；步骤四、细胞株的培养取人体肺癌细胞株Spc‑A1细胞，置于10％胎牛血清的RPMI‑1640完全培养液中，在CO₂浓度为5％的饱和湿度培养箱内进行37℃恒温培养，贴壁细胞采用0.25％胰蛋白酶进行消化传代，取对数生长期细胞备用；步骤五、MTT溶液的配制称取MTT250mg，用PBS磷酸缓冲盐溶液溶解定溶至50ml容量瓶中，溶解完全后采用0.22μm的滤膜进行过滤除菌，在4℃的条件下，避光保存备用；步骤六、阳性对照药环磷酰胺的配制称取环磷酰胺0.01mg，用1640无血清溶液溶解稀释至0.1μg/ml，过半径为0.45μm的滤膜，获得溶液备用；步骤七、山梗菜中抗肿瘤活性的测定将所述步骤四获得的处于对数生长期的Spc‑A1细胞按1xl0⁵/孔接种至96孔板中培养，待细胞贴壁后，弃去培养液，分别加入含对照药物的培养液、无对照药物的培养液以及阳性对照培养液，对照药物分别为总生物碱、石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、氯仿萃取部位以及正丁醇萃取部位，药物终浓度分别为100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml，无对照药物的培养液为无血清RPMI‑1640培养液，阳性对照培养液为0.1μg/ml的环磷酰胺；每组药物培养设3个复孔，将给药后的细胞置于37℃、CO₂浓度为5％的饱和湿度培养箱中培养44h，加入浓度为5mg/ml的MTT溶液20μl，继续培养4h，培养结束后弃去培养液，加入二甲基亚砜DMSO100μl，震荡溶解10min，采用全自动酶标仪于波长490nm处测定吸光度值，用均数进行比较，获得肿瘤细胞抑制率。