[发明专利]一种抗O型和A型口蹄疫病毒卵黄抗体的制备方法、产品及其用途

摘要

本发明公开了一种抗O型和A型口蹄疫病毒卵黄抗体的制备方法、产品及其用途。本发明的抗体制备方法是：用含有口蹄疫病毒O型VP1蛋白和灭活后的A型口蹄疫全病毒抗原的疫苗免疫非免疫产蛋母鸡；收集免疫后的产蛋母鸡所产的鸡蛋，通过粗提及亲和纯化柱纯化后获得抗O型和A型口蹄疫病毒卵黄抗体。实验证明，由本发明方法制备得到的卵黄抗体能够与口蹄疫O型以及A型病毒抗原结合，此外，由本发明方法制备得到的卵黄抗体在室温下较稳定，可存放较长时间，对温度和pH的稳定性较好，而且制备方法简单，成本低，效价高。因此，本发明所建立的方法及其产品在FMDV的诊断及预防方面具有良好的应用前景。

主权项

1.一种抗口蹄疫病毒(FMDV)O型和A型卵黄抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)用含有口蹄疫病毒O型VP1蛋白和灭活后的A型口蹄疫全病毒抗原的疫苗免疫非免疫产蛋母鸡；(2)收集免疫后的产蛋母鸡所产的鸡蛋；(3)卵黄抗体的粗提①用75％(v/v)酒精浸泡鸡蛋5～10min，用清水冲洗，再用无菌纱布将鸡蛋擦干；②小心打破鸡蛋，分离蛋黄，然后将蛋黄置于灭菌的粗滤纸上，轻轻滚动，直至蛋清被吸干；③用小针刺破蛋黄膜，放入离心管中，记录蛋黄重量；④采用6倍蛋黄体积的pH＝7.40，0.01M的PBS缓冲液稀释卵黄，加入PEG‑6000使其终浓度达到8％(w/w)进行沉淀，10000r/min离心20min，收集上清液，即卵黄水溶液，备用；(4)卵黄抗体的纯化①琼脂糖活化②蛋白偶联：将需偶联的FMDV O型抗原和A型抗原混合物置于0.1mol/L pH值7.8 NaHCO₃液中透析2小时；将活化的琼脂糖迅速倒入FMDV抗原液中，4℃缓慢搅拌过夜，使蛋白与活化的琼脂结合，得到偶联FMDV O型抗原和A型抗原的琼脂糖；③装柱洗柱装柱：将已与FMDV抗原偶联的琼脂糖装入层析柱内，拧紧下口夹，让其下沉，5‑8分钟后松开下口夹，使溶液以1ml/min的速度流出；洗柱：以pH为9.0，含0.1mol/L NaCl的0.2mol/L NaHCO₃溶液洗涤至洗出液的OD₂₈₀＜0.02为止，得到亲和纯化柱，备用；④抗体的纯化平衡：用超纯水和pH7.4，含1M NaCl的0.02M PBS缓冲液冲洗亲和纯化柱至紫外检测器显示示数稳定；上样：向待纯化的卵黄水溶液中加入pH7.4，含1M NaCl的0.02M PBS缓冲液，将稀释后的卵黄水溶液加入亲和纯化柱中，流速为100ml/h；冲洗：上样结束后，用pH7.4，含1M NaCl的0.02M PBS缓冲液冲洗亲和纯化柱至流出液在紫外检测器显示示数稳定；洗脱：使用pH3.5的0.1M柠檬酸缓冲液以1.0ml/min冲洗亲和纯化柱，收集第55～60min的洗脱液，即得抗口蹄疫病毒O型和A型卵黄抗体。