[发明专利]一种基因热点突变的检测方法

摘要

发明名称一种基因热点突变的检测方法摘要本发明通过采用体外对野生序列进行限制性内切酶消化和将切口处末端进行不利于连接反应的处理，将体外扩增片段亚克隆，然后对克隆形成的菌落进行测序分析。本发明有利于突变基因形成菌落而对野生基因片段由于被限制性内切酶反应和抑制连接处理其形成菌落的能力下降。本发明对突变基因含量低的生物标本的基因突变分析方面具有应用价值。

主权项

1.一种对野生型基因和突变基因进行非疾病诊断与治疗目的的突变基因分析的方法，其特征在于，所述的野生型基因为KRAS基因，所述的突变基因为KRAS基因第12位密码子热点突变基因；所述方法包括如下步骤：（1）与KRAS基因第12位密码子热点突变对应的野生序列质粒构建：以人血基因组为模板，以SEQ ID NO：2和3所示的引物a和d进行PCR，构建野生模板；PCR产物纯化后连接PMD‑19T质粒，最后转化DH5α大肠杆菌，挑取克隆测序；（2）KRAS基因第12位密码子热点突变序列质粒构建：第一轮PCR：以人血基因组为模板，以SEQ ID NO：2和4所示的引物a和b进行PCR，产物为ab；以人血基因组为模板，以SEQ ID NO：5和3所示的引物c、d，进行PCR，产物为cd；第二轮PCR：以第一轮PCR的产物ab和cd互为模板相互延伸形成ad，PCR扩增体系为：2×Taqmix 12.5µl，产物ab片段1.0µl，产物cd片段 1.0µl，10µM的引物a 0.5µl，10µM的引物d 0.5µl，补足H2O至25µl；PCR产物纯化、连接，转化DH5α大肠杆菌，克隆后产物挑菌落，测序；（3）PCR扩增野生与含第12位密码子突变的基因片段：模板为上述构建的野生序列质粒和第12位密码子热点突变序列质粒，引物为SEQ ID NO：6和7所示的引物e和f；（4）将步骤（3）的PCR产物纯化酶切，酶切采用限制性内切酶 BstnI；酶切后的PCR产物纯化；（5）对消化切口进行阻碍连接酶反应的处理：将步骤（4）酶切后的PCR产物用rSAP去磷酸化；（6）用连接酶介导连接反应，最后对亚克隆所形成的菌落进行突变分析。