[发明专利]一种B型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备方法及联合疫苗

摘要

本发明公开了一种B型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备方法，包括发酵培养、灭菌沉淀、多糖提取和纯化、多糖衍生以及多糖蛋白结合物的制备。本发明还公开了将无细胞百日咳原液、精制白喉类毒素、精制破伤风类毒素加入氢氧化铝吸附后再加入B型流感嗜血杆菌荚膜多糖原液，然后使用生理盐水稀释制得多价联合疫苗。本发明公开的制备方法，对现有技术进行了优化，可以获得高纯度、低杂质的B型流感嗜血杆菌荚膜多糖，同时本发明通过与多组分疫苗组合形成多价疫苗，可以同时对多种疾病进行免疫，减少接种次数，降低医疗风险，可以一次接种获得更好的免疫效果。

主权项

一种B型流感嗜血杆菌荚膜多糖的制备方法，包括以下步骤：(1)发酵培养：将B型流感嗜血杆菌接种到发酵罐中发酵，并于对数生长的后期或静止期的前期终止培养，获得培养液；(2)灭菌沉淀：将培养液灭菌后高速离心，收集上清液，并在上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵充分混匀，然后静置再离心，收集沉淀物；(3)多糖提取和纯化在B型流感嗜血杆菌的沉淀物中加入氯化钠溶液中解离，解离后离心收集上清液；上清液先进行超滤浓缩，浓缩后加入乙醇至乙醇质量分数为20％，低温静置后离心去除沉淀，然后离心液中加入无水乙醇至乙醇含量为85％，低温静置后离心，收集沉淀并使用无水乙醇和丙酮洗涤，然后在沉淀中加入水溶解，溶解液再次离心，并将离心液进行透析处理；浓缩得到粗制多糖；将粗制多糖溶于饱和醋酸钠溶液中，加入冷酚溶液抽提数次；然后搅拌离心收集上清液，并通过超滤或者透析脱酚，再加入乙醇至终浓度为60％～80％，离心后收集沉淀物，沉淀物使用无水乙醇和丙酮洗涤，然后真空干燥得到精制多糖；(4)多糖衍生将精制多糖溶于蒸馏水中调节pH值至10.5～11，温度20℃～26℃下活化，然后加入酸液至pH为9，然后加入己二酸二酰肼ADH反应，反应完毕后调节pH值至弱碱性搅拌12h以上，然后透析、过滤、干燥；得到多糖衍生品；(5)多糖蛋白结合物的制备将多糖衍生品与载体蛋白混合后调节pH值至5.5～5.9，加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺EDC于2℃～8℃反应，反应完毕后调节pH值至6.7～7.1透析，透析液经过柱层析纯化、浓缩后使用超滤膜除菌，得到B型流感嗜血杆菌荚膜多糖。