[发明专利]一种防治鸡心包积液-肝炎综合征生物兽药的制备方法

摘要

本发明涉及生物兽药技术领域，尤其是一种防治鸡心包积液‑肝炎综合征生物兽药的制备方法，其制作步骤是抗原的制备、抗原EID50的测定、制备灭活疫苗、产蛋鸡的免疫、高免蛋的收集和提取抗鸡心包积液‑肝炎综合征卵黄抗体，本发明提供一种治疗鸡心包积液‑肝炎综合征卵黄抗体生物兽药，通过用鸡心包积液‑肝炎综合征患病鸡的肝组织匀浆液接种鸡胚增殖病毒，并制得灭活疫苗免疫产蛋鸡，然后从蛋黄中提取的一种蛋白质。将该蛋白质用于防治鸡心包积液‑肝炎综合征，来解决目前没有合适的治疗鸡心包积液‑肝炎综合征针对性兽用药物、现有流行的治疗方案成本高、效果差的问题。

主权项

一种防治鸡心包积液‑肝炎综合征生物兽药的制备方法，其特征在于，按如下步骤制得：（1）抗原的制备A:组织匀浆液的制备：收集病患鸡的肝脏，用生理盐水洗2～3次，除去血液，剥除表面的结缔组织的脂肪，剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血色止，然后再加1：1‑10重量比的冷生理盐水，用组织捣碎机10000‑15000r/min上下研磨15‑30分钟，制成组织匀浆液；B、冻融、过滤、除菌：组织匀浆液反复冻融3次后，离心后收集上清液，0.22μm微孔过滤除菌；C、增殖：将步骤B所得上清液做5‑15倍稀释，接种10日龄鸡胚尿囊腔内，每枚鸡胚接种0.2ml，37℃孵化4d后收获尿囊液；（2）抗原EID50的测定将所制得的抗原，一次做10倍稀释，进行鸡胚尿囊腔接种，每个稀释度接种0.1ml，做9个重复，同时设正常胚对照，置于37℃孵化48小时，弃掉24h内死亡胚，收获24h后死亡胚及48h活胚的尿囊液，进行HA价的测定，按照Reed‑muench方法计算EID50；（3）制备灭活疫苗将所制得尿囊液，用生理盐水稀释至10^‑5‑10^‑10EID50/0.1ml，用终浓度为0.3的甲醛在37℃下灭活24h，即为制苗用抗原，把抗原乳化制成油乳剂灭活疫苗，并进行灭活疫苗的安全检验；（4）产蛋鸡的免疫选取30周龄的健康产蛋鸡，用安全检验合格的灭活疫苗进行免疫，免疫程序为：第一次免疫：每只鸡颈部皮下注射0.2ml；第二次免疫：2周后，每只鸡颈部皮下注射0.4ml；第三次免疫：2周后，每只鸡颈部皮下注射1ml；（5）高免蛋的收集产蛋鸡第三次免疫后10‑14天，开始抽样测定高免鸡蛋蛋黄中抗鸡心包积液‑肝炎综合征卵黄抗体效价，蛋黄与1.8%浓度的盐水按照体积比1：1稀释，然后按照体积比1：1加入6‑8%的PEG6000溶液，保证溶液的盐浓度为0.9%、PEG6000浓度为3‑4%，搅拌均匀后，常温放置1‑2小时，然后3000rpm离线15‑20分钟，取清液，测定HI效价，HI效价≥6即为合格，之后收集鸡蛋；（6）提取抗鸡心包积液‑肝炎综合征卵黄抗体A、鸡蛋消毒：将鸡蛋清洗干净，然后，浸入37‑40℃的消毒液中消毒15‑20分钟，取出晾干备用；B、分离蛋黄：将已消毒晾干的鸡蛋打破后，充分去除蛋清、系带，收集蛋黄；C、提取抗体：将蛋黄液与同体积PBS溶液混合后搅拌均匀，然后用6‑8%的PEG6000溶液对混合液进行体积比1：1的混合均匀，然后静置2‑3小时，然后3000rpm离心15‑20分钟，收集上清液；D、加入灭活剂和稳定剂：上清液按终浓度体积比为0.05%加入甲醛，充分搅拌混合，密封1‑2小时后加入终浓度重量比0.02%的稳定剂吐温‑20，混合均匀；E、过滤除菌：用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得到抗鸡心包积液‑肝炎综合征卵黄抗体生物制剂药物，主要成分为卵黄抗体；F、安全检验，形成产品：用3只20g的小白鼠做安全性检验，每只小白鼠腹腔注射0.5ml步骤E所得抗体液，观察7天，无任何异常反应为合格。