[发明专利]一种防治鸡心包积液-肝炎综合征生物兽药的制备方法

权利要求书

1.一种防治鸡心包积液-肝炎综合征生物兽药的制备方法，其特征在于，按如下步骤制 得：

（1）抗原的制备

A:组织匀浆液的制备：收集病患鸡的肝脏，用生理盐水洗2～3次，除去血液，剥除表面 的结缔组织的脂肪，剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血色止，然后再加1：1-10重量比的冷生 理盐水，用组织捣碎机10000-15000r/min上下研磨15-30分钟，制成组织匀浆液；

B、冻融、过滤、除菌：组织匀浆液反复冻融3次后，离心后收集上清液，0.22μm微孔过滤 除菌；

C、增殖：将步骤B所得上清液做5-15倍稀释，接种10日龄鸡胚尿囊腔内，每枚鸡胚接种 0.2ml，37℃孵化4d后收获尿囊液；

（2）抗原EID50的测定

将所制得的抗原，一次做10倍稀释，进行鸡胚尿囊腔接种，每个稀释度接种0.1ml，做9 个重复，同时设正常胚对照，置于37℃孵化48小时，弃掉24h内死亡胚，收获24h后死亡胚及 48h活胚的尿囊液，进行HA价的测定，按照Reed-muench方法计算EID50；

（3）制备灭活疫苗

将所制得尿囊液，用生理盐水稀释至10^-5-10^-10EID50/0.1ml，用终浓度为0.3的甲醛在 37℃下灭活24h，即为制苗用抗原，把抗原乳化制成油乳剂灭活疫苗，并进行灭活疫苗的安 全检验；

（4）产蛋鸡的免疫

选取30周龄的健康产蛋鸡，用安全检验合格的灭活疫苗进行免疫，免疫程序为：

第一次免疫：每只鸡颈部皮下注射0.2ml；

第二次免疫：2周后，每只鸡颈部皮下注射0.4ml；

第三次免疫：2周后，每只鸡颈部皮下注射1ml；

（5）高免蛋的收集

产蛋鸡第三次免疫后10-14天，开始抽样测定高免鸡蛋蛋黄中抗鸡心包积液-肝炎综合 征卵黄抗体效价，蛋黄与1.8%浓度的盐水按照体积比1：1稀释，然后按照体积比1：1加入6- 8%的PEG6000溶液，保证溶液的盐浓度为0.9%、PEG6000浓度为3-4%，搅拌均匀后，常温放置 1-2小时，然后3000rpm离线15-20分钟，取清液，测定HI效价，HI效价≥6即为合格，之后收集 鸡蛋；

（6）提取抗鸡心包积液-肝炎综合征卵黄抗体

A、鸡蛋消毒：将鸡蛋清洗干净，然后，浸入37-40℃的消毒液中消毒15-20分钟，取出晾 干备用；

B、分离蛋黄：将已消毒晾干的鸡蛋打破后，充分去除蛋清、系带，收集蛋黄；

C、提取抗体：将蛋黄液与同体积PBS溶液混合后搅拌均匀，然后用6-8%的PEG6000溶液 对混合液进行体积比1：1的混合均匀，然后静置2-3小时，然后3000rpm离心15-20分钟，收集 上清液；

D、加入灭活剂和稳定剂：上清液按终浓度体积比为0.05%加入甲醛，充分搅拌混合，密 封1-2小时后加入终浓度重量比0.02%的稳定剂吐温-20，混合均匀；

E、过滤除菌：用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得到抗鸡心包积液-肝炎综合征卵黄抗体 生物制剂药物，主要成分为卵黄抗体；

F、安全检验，形成产品：用3只20g的小白鼠做安全性检验，每只小白鼠腹腔注射0.5ml 步骤E所得抗体液，观察7天，无任何异常反应为合格。

2.根据权利要求1所述的防治鸡心包积液-肝炎综合征生物兽药的制备方法，其特征在 于，所述病患鸡的肝脏可以是淋巴组织。

3.根据权利要求1所述的防治鸡心包积液-肝炎综合征生物兽药的制备方法，其特征在 于，所述病患鸡是指剖检可见典型鸡心包积液-肝炎综合征症状的鸡，尤其是指同时可见心 包积液和肝炎症状的鸡。

4.根据权利要求1所述的防治鸡心包积液-肝炎综合征生物兽药的制备方法，其特征在 于，第（1）步骤中的B、C步骤可以是组织匀浆液反复冻融3次后，加入1倍生理盐水稀释混匀， 再加入青链霉素双抗溶液，终浓度为200IU/ml。