[发明专利]一种来源于马克斯克鲁维酵母的烷基过氧化物还原酶和硫氧还蛋白还原酶及其应用

摘要

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种来源于马克斯克鲁维酵母的烷基过氧化物还原酶和硫氧还蛋白还原酶及其在提高胁迫耐受性方面的应用。烷基过氧化物还原酶基因KmTPX1基因含有594个核苷酸，编码197个氨基酸；KmTrxR基因含有960个核苷酸，编码319个氨基酸。同时，本发明所示的KmTPX1基因和KmTrxR基因能够提高酵母细胞对于多种抑制物或胁迫因子的耐受能力，如过氧化氢、甲酸、乙酸、糠醛、乙醇、氯化钠、苯酚、愈创木酚中的一种或几种。对于甲酸、乙酸、糠醛、乙醇以及盐离子浓度耐受能力的提高，使得烷基过氧化物还原酶基因和硫氧还蛋白还原酶基因在构建优良的纤维素乙醇发酵菌株方面具有至关重要的作用。

主权项

1.一种硫氧还蛋白还原酶KmTrxR在提高酵母对甲酸或乙酸耐受能力中的应用，其特征在于，该硫氧还蛋白还原酶KmTrxR的核苷酸序列为：  1 ATGGTTCATC ACAAGGTAAC AATTATTGGT TCCGGCCCAG CAGCCCACAC 51 CGCCGCCATT TACTTGGCTA GAGCAGAAAT CAAGCCTACC CTATACGAAG101 GTTTCATGGC TAATGGTATC GCCGCCGGTG GTCAACTAAC AACCACCACT151 GAAATCGAAA ACTTCCCAGG TTTCCCAGAA GGTTTGACCG GTAGTGAATT201 GATGGATAAG ATGAAGGCTC AATCTGTCAA GTTTGGTACC GAGGTGATTA251 CCGAAACCGT TGCAAAGGTG GACTTGTCTA GCAAGCCATT CAAGTTCTGG301 ACCGAATTCA ACGAGGACCA AGAACCAGAA ACTACCGATG CCATTATCTT351 GGCTACCGGT GCCTCCGCTA AGCGTCTACA CTTGCCAGGT GAAGAGAAGT401 ACTGGCAACA GGGTATCTCC GCCTGTGCCG TTTGTGACGG TGCAGTGCCA451 ATCTTCAGAA ACAAGCCATT GGCTGTCATC GGTGGTGGTG ACTCTGCCTG501 TGAAGAAGCA CAATTTTTGA CCAAGTACGG TTCCAAGGTG TACATGCTTG551 TCAGAAAGGA CCACTTGCGT GCCTCTCAAA TCATGCAAAG ACGTGCTGAA601 CAAAACGAAA AGATCGAAAT CTTGTACAAC CACGTCACCT TGGAAGCCAA651 GGGTGACGAC AAGTACTTGA ATGCATTGAA GGTCAAGAAC GTAAAGACCA701 ATGAAGAATA CGACTTGCCA GTTAACGGAT TATTCTACGC CATTGGTCAC751 TCCCCAGCTA CCAAAATTGT TGCTGGACAA GTCGATCTTG ACGATGCTGG801 CTACGTTAAG ACCGTCCCAG GCTCCTCTTT GACTAGCGTC CCAGGTGTTT851 TCGCTGCTGG TGATGTCCAA GATTCTAGAT ACAGACAAGC TATCACTTCC901 GCTGGCTCTG GTTGTATGGC CGCTTTGGAT GCTGAAAAGT ACCTAACTGA951 ATTGGAATAA该核苷酸序列中含有960个核苷酸，编码319个氨基酸；所述的硫氧还蛋白还原酶KmTrxR来源于马克斯克鲁维酵母，以其基因组为模板，上游引物TrxR‑F, 5’‑TCCGAGCTCCCCATGTCAAATGATGAAACG‑3’和下游引物TrxR‑R, 5’‑TCCCCGCGGACGAGGAACCAACCTTTATT‑3’，通过聚合酶链式反应扩增方式获得所述的硫氧还蛋白还原酶KmTrxR；硫氧还蛋白还原酶KmTrxR编码区长度为960 bp编码序列，编码319个氨基酸；以酿酒酵母多拷贝质粒pRS425为基本骨架，根据其酶切位点特性，选择SacI和SacII酶切位点插入KmTrxR基因片段，KmTxrR片段来源于前述经过PCR得到的纯化产物；经过酶切后对相应DNA片段进行回收纯化，用T4连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5α，重组质粒经过酶切验证后命名为pRS425‑TrxR；将构建好的重组质粒和空载质粒分别按照LiAc/PEG方法转化入S. cerevisiae280中，以营养缺陷型的筛选标记进行转化子的筛选，获得的转化子经验证后即为能够实现提高胁迫因子耐受性的重组酵母菌株；功能分析与验证将过表达硫氧还蛋白还原酶KmTrxR的重组酵母菌株命名为TrxR，含有空载质粒pRS425的重组酵母菌株命名为425；TrxR以425作为对照，在缺少亮氨酸的SD培养基中进行活化培养；经活化后的TrxR和425两种酵母菌分别按照v/v 1%的接种量接种至含有1 mM H₂O₂的SD培养基中，30^oC，150 rpm培养16‑18 h后成为种子液；将种子液OD₆₂₀调成一致，10倍梯度稀释，点样于缺乏相应氨基酸的SD固体检测平板；平板中分别添加不同的抑制物或者胁迫因子通过观察菌体生长状况来表征不同菌株对于不同抑制物或胁迫因子的耐受能力；所述的抑制物或者胁迫因子为甲酸或乙酸。