[发明专利]一种来源于马克斯克鲁维酵母的烷基过氧化物还原酶和硫氧还蛋白还原酶及其应用

说明书

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种来源于马克斯克鲁维酵母的烷基过氧化物还原酶和硫氧还蛋白还原酶及其在提高胁迫耐受性方面的应用。烷基过氧化物还原酶基因KmTPX1基因含有594个核苷酸，编码197个氨基酸；KmTrxR基因含有960个核苷酸，编码319个氨基酸。同时，本发明所示的KmTPX1基因和KmTrxR基因能够提高酵母细胞对于多种抑制物或胁迫因子的耐受能力，如过氧化氢、甲酸、乙酸、糠醛、乙醇、氯化钠、苯酚、愈创木酚中的一种或几种。对于甲酸、乙酸、糠醛、乙醇以及盐离子浓度耐受能力的提高，使得烷基过氧化物还原酶基因和硫氧还蛋白还原酶基因在构建优良的纤维素乙醇发酵菌株方面具有至关重要的作用。

技术领域

本发明属于微生物基因工程应用领域，具体涉及包含提供来源于马克斯克鲁维酵母的烷基过氧化物还原酶KmTPX1的基因和氨基酸序列，以及硫氧还蛋白还原酶KmTrxR的基因和氨基酸序列。同时本发明也涉及了上述两种酶在提高酿酒酵母胁迫耐受性方面的应用。

背景技术

酵母长期以来一直就是被人们广泛关注的微生物，它可以广泛应用与食品、医药、酿酒等多种工业领域。特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，因其在最初在酿酒工业的重要应用，一直以来都是研究最为广泛的酵母之一，无论是传统的酿酒工业，还是新兴的生物乙醇，甚至是基因工程领域，酿酒酵母的应用研究都取得了了巨大的进展。近年来，一种非传统酵母，马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)越来越受到人们的关注，因为它具有耐高温条件、生长速率较快、利用底物种类广泛等诸多优势有望广泛应用于工业生物技术领域。尽管K.marxianus研究的较晚，而且许多问题仍待于进一步的理论研究来解决，但是随着基因组学和转录组学技术的不断完善，越来越多来源于马克斯克鲁维酵母的新基因或者新酶被报道(Lertwattanasakul et al.Biotechnol Biofuels.2015，8：1-14.)，为其进一步的研究与利用奠定了基础。

生物乙醇是目前为止研究最早、技术最为成熟的生物质能源产品，被公认为最有可能替代化石能源的生物质能源之一。而纤维素乙醇以其广泛的原料来源是国内外燃料乙醇研发的重点。但是，纤维素结构复杂，需要对纤维素原料进行预处理和水解将其转化成酵母可直接利用的单糖。然而，当前高效的纤维素预处理方法(如蒸汽爆破法，酸法，碱法等)在处理过程中都会产生多种抑制物，影响酵母菌的后续发酵过程，成为纤维素质能源工业化生产的重要挑战(Palmqvis et al.Bioresource Technol.2000，74，25-33.)。

纤维素水解液中的抑制物主要包括三类：弱酸(如甲酸、乙酸等)，呋喃醛类(如糠醛，5-羟甲基糠醛等)，酚类化合物(如4-水杨酸，苯酚等)(Palmqvis et al.BioresourceTechnol.2000，74，25-33.)。纤维素水解液中的多种抑制物对细胞的毒害作用机理是非常复杂的，尽管可以通过一些技术对纤维素水解液进行脱毒反应(Lee et al.J Ind EngChem.2013，19，2010-2015.)，但随之导致的糖损失和成本增加使得脱毒并不是一种理想之选。因此，探索不同的抑制物胁迫因子对细胞产生毒害的机理，从而获得一些耐受性提高的发酵菌株将是解决纤维素乙醇瓶颈问题的关键。

酵母细胞生长需要氧，但是过量的通气会产生对细胞有害的物质，被称为活性氧(ROS)，包括超氧化物、过氧化物以及氢氧自由基等(Arellano-Plaza，et al.World JMicrobiol Biotechnol.2013，29：1279-1287.)。因此，为了防御活性氧的伤害，细胞具有一套完善的防御机制，其中主要涉及一些氧化还原的酶类。之前的一些报道表明，细胞内活性氧的水平或者一些氧化还原酶的表达与细胞对纤维素水解液中抑制物的耐受能力有关(Kumar，et al.PloS one，2015，10(10)：e0139129.)。但是，目前关于马克斯克鲁维酵母来源的氧化还原酶的报道十分有限，关于其功能的研究更少。本发明提供了两种马克斯克鲁维酵母来源的氧化还原酶，烷基过氧化物还原酶KmTPX1和硫氧还蛋白还原酶KmTrxR。