[发明专利]一种同时测定微生物酶法产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺反应体系中五种物质的高效液相检测方法

摘要

公开了一种可以同时测定微生物酶法产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺反应体系中五种物质(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，L-谷氨酰胺，L-丙氨酸甲酯，L-谷氨酸，L-丙氨酰-L-丙氨酸)的高效液相检测方法。利用邻苯二甲醛对五种物质进行柱前自动化衍生处理，使其具有强荧光基团，用荧光检测器检测。其色谱条件如下：高效液相色谱仪：Agilent 1260 Infinity；色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq，5μm，4.6×250mm C18柱；检测器：Agilent 1260 Infinity荧光检测器；流动相组成：乙腈与磷酸盐缓冲液的体积比为12：88，磷酸调节流动相pH至7.4；流动相流速：1.0ml/min；柱室温度：40℃；检测波长：激发波长Ex 338nm，发射波长Em 450nm。该方法实现了寡肽、氨基酸与氨基酸衍生物的同时测定，操作简单，灵敏度高，具有重要的应用价值。

主权项

一种同时测定微生物酶法产L‑丙氨酰‑L‑谷氨酰胺反应体系中五种物质(L‑丙氨酰‑L‑谷氨酰胺，L‑谷氨酰胺，L‑丙氨酸甲酯，L‑谷氨酸，L‑丙氨酰‑L‑丙氨酸)的高效液相检测方法，其特征在于该检测方法包括如下步骤：(1)色谱条件：高效液相色谱仪：Agilent 1260Infinity；色谱柱：Agilent ZORBAX SB‑Aq，5μm，4.6×250mm C18柱；检测器：Agilent 1260Infinity荧光检测器；流动相组成：乙腈与磷酸盐缓冲液的体积比为12：88，磷酸调节流动相pH至7.4；流动相流速：1.0ml/min；柱室温度：40℃；检测波长：激发波长Ex 338nm，发射波长Em 450nm；运行时间：20min。(2)标准品配制：于分析天平上分别精确称取一定质量的L‑丙氨酰‑L‑谷氨酰胺，L‑谷氨酰胺，L‑丙氨酸甲酯盐酸盐，L‑谷氨酸，L‑丙氨酰‑L‑丙氨酸，统一用10mL容量瓶配制成浓度为4mM的母液。后续试验所需标品都用4mM母液搭配稀释获得。(3)流动相的配制磷酸盐缓冲液的配制：分别配制浓度同为12.5mM的磷酸氢二钾与磷酸二氢钾溶液，二者互调pH至7.4。将上述磷酸盐缓冲液与色谱纯乙腈按88：12比例进行等度洗脱即可。(4)衍生剂配制：50mg邻苯二甲醛，100μLβ‑巯基乙醇，加入300μL甲醇溶解，加入1.6mL硼砂缓冲液(pH10.0)混匀既得。pH10.0的硼砂缓冲液配制：分别配制0.05M硼砂溶液与0.2M氢氧化钠溶液，准确移取50mL硼砂溶液与23mL氢氧化钠溶液到200mL容量瓶中，混合均匀，并用水稀释到刻度线既得。(5)柱前自动化在线衍生程序：吸取2μl样品，2μl衍生剂混合3次，吸取16μl硼酸缓冲液混合15次，最后在吸取20μl流动相混合5次后进样。该程序可表示为：2μl样品+2μl衍生剂+16μl硼酸缓冲液+20μl流动相。每次吸取完毕后，都需运行洗针程序。