[发明专利]一种同时测定微生物酶法产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺反应体系中五种物质的高效液相检测方法

说明书

技术领域

一种同时检测微生物酶法产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺反应体系中五种物质的高效液相检测 方法，属于分析测试方法技术领域。

背景技术

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-alanyl-L-glutamine，L-Ala-L-Gln)是一种由L-丙氨酸与L-谷氨酰 胺两种氨基酸脱水缩合形成的一种二肽，简称丙谷二肽。L-谷氨酰胺(L-Gln)作为一种条件 必需氨基酸在医药行业中应用极其广泛。L-谷氨酰胺可作为糖异生和尿素合成的原料，神经 递质的前体物质，同时还是体内生化代谢途径的重要中间体。由于具有不同于L-谷氨酰胺的 理化性质，丙谷二肽克服了L-谷氨酰胺的溶解度低、热不稳定性等缺点，因此常常被用作 L-谷氨酰胺的替代品以注射液的形式而应用于临床。

目前主要通过化学合成法来生产丙谷二肽，化学合成法通常需要添加与去除有毒的保护 基这一过程，该方法通常存在合成过程复杂、生产成本高、易生成副产物、目的产物提纯困 难、合成条件苛刻、所用试剂有害等缺点，所以化学合成法不能大规模应用于商业领域。针 对上述现状，本实验室率先在国内开展了有关微生物酶法产丙谷二肽的研究。目前本实验室 已经构建出了一系列具备生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺能力的微生物菌种，并且已经能够利用这 些菌种实现L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生物制备。因此，我们急需一种稳定，准确，快速的检测 方法来定量分析反应体系中各个物质的含量，以便于我们对所构建出的菌种进行性能评估， 以及最优发酵条件与最优反应条件的摸索。

L-丙氨酸甲酯盐酸盐(L-AlaOMe·Hcl)在水溶液中以L-丙氨酸甲酯(L-AlaOMe)的形式 存在。本实验室所构建出的菌种可以表达α-氨基酸酯酰基转移酶，在该酶的作用下，L-丙氨 酸甲酯(L-AlaOMe)的酯酰基可以脱除进而与L-谷氨酰胺的氨基缩合形成目的产物丙谷二肽。 与此同时，脱除酯酰基后的L-丙氨酸甲酯同样可以与其自身的氨基缩合形成L-丙氨酰-L-丙氨 酸(L-Ala-L-Ala)这一副产物。两种底物在反应体系中不可能完全消耗因此会有剩余。此外， L-谷氨酰胺不稳定，在反应过程中会有部分降解为L-谷氨酸(L-Glu)。因此，在整个反应体 系中共存在L-丙氨酰-L-谷氨酰胺与L-丙氨酰-L-丙氨酸两种二肽，L-谷氨酰胺与L-谷氨酸两种 氨基酸，L-丙氨酸甲酯一种氨基酸衍生物这五种物质。虽然通过高效液相法测定氨基酸已经 有很多方法来实现，但是关于用高效液相法测定二肽的报道并不多见，而用高效液相法同时 测定寡肽，氨基酸以及氨基酸衍生物这三类物质更无任何报道。

相比于紫外与视差检测，荧光检测具有灵敏度与响应值高，定量精确的优点。邻苯二甲 醛(OPA)在巯基乙醇的保护下可以和氨基结合从而形成具有强荧光的基团，可用于荧光检 测。在本发明所述的反应体系中，五种物质都还具有游离的氨基，因此都可以被OPA衍生 而形成具有强荧光的产物，从而顺利的通过荧光检测器的检测。而柱前自动化在线衍生相比 于传统的手动衍生，操作更为规范，有效地避免了人为误差，可以大大的提高测量精度。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于同时检测微生物酶法产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺反应体系中 五种物质的高效液相检测方法。该方法实现了微生物酶催化法产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺反应体 系中一种主产物L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，一种副产物L-丙氨酰-L-丙氨酸，两种底物L-丙氨酸甲 酯和L-谷氨酰胺，以及一种干扰物L-谷氨酸的同时测定。该方法以OPA为衍生化试剂对标 准品以及反应液进行柱前自动化在线衍生，通过荧光检测器检测。该方法具有可以同时测定 五种物质，各个物质峰分离度高，重复性好，测量精度与准确度高，样品运行时间短(20min)， 等度洗脱简便等优势。

本发明是一种同时检测微生物酶法产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺反应体系中五种物质的高效 液相检测方法，其特征在于该检测方法包括如下步骤：

(1)色谱条件：

高效液相色谱仪：Agilent1260Infinity；

色谱柱：AgilentZORBAXSB-Aq，5μm，4.6×250mmC18柱；

检测器：Agilent1260Infinity荧光检测器；

流动相组成：乙腈与磷酸盐缓冲液的体积比为12：88，磷酸调节流动相pH至7.4；

流动相流速：1.0ml/min；

柱室温度：40℃；