[发明专利]一种同时测定微生物酶法产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺反应体系中五种物质的高效液相检测方法

权利要求书

1.一种同时测定微生物酶法产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺反应体系中五种物质(L-丙氨酰-L- 谷氨酰胺，L-谷氨酰胺，L-丙氨酸甲酯，L-谷氨酸，L-丙氨酰-L-丙氨酸)的高效液相检测方法， 其特征在于该检测方法包括如下步骤：

(1)色谱条件：

高效液相色谱仪：Agilent1260Infinity；

色谱柱：AgilentZORBAXSB-Aq，5μm，4.6×250mmC18柱；

检测器：Agilent1260Infinity荧光检测器；

流动相组成：乙腈与磷酸盐缓冲液的体积比为12：88，磷酸调节流动相pH至7.4；

流动相流速：1.0ml/min；

柱室温度：40℃；

检测波长：激发波长Ex338nm，发射波长Em450nm；

运行时间：20min。

(2)标准品配制：

于分析天平上分别精确称取一定质量的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，L-谷氨酰胺，L-丙氨酸甲 酯盐酸盐，L-谷氨酸，L-丙氨酰-L-丙氨酸，统一用10mL容量瓶配制成浓度为4mM的母液。 后续试验所需标品都用4mM母液搭配稀释获得。

(3)流动相的配制

磷酸盐缓冲液的配制：分别配制浓度同为12.5mM的磷酸氢二钾与磷酸二氢钾溶液，二 者互调pH至7.4。将上述磷酸盐缓冲液与色谱纯乙腈按88：12比例进行等度洗脱即可。

(4)衍生剂配制：

50mg邻苯二甲醛，100μLβ-巯基乙醇，加入300μL甲醇溶解，加入1.6mL硼砂缓冲液 (pH10.0)混匀既得。pH10.0的硼砂缓冲液配制：分别配制0.05M硼砂溶液与0.2M氢氧化 钠溶液，准确移取50mL硼砂溶液与23mL氢氧化钠溶液到200mL容量瓶中，混合均匀，并 用水稀释到刻度线既得。

(5)柱前自动化在线衍生程序：

吸取2μl样品，2μl衍生剂混合3次，吸取16μl硼酸缓冲液混合15次，最后在吸取20μl 流动相混合5次后进样。该程序可表示为：2μl样品+2μl衍生剂+16μl硼酸缓冲液+20μl流动 相。每次吸取完毕后，都需运行洗针程序。

2.根据权利要求1所述的一种同时检测微生物酶法产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺反应体系中五 种物质的高效液相检测方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述高效液相色谱仪包括但不 局限于Agilent，Waters，Hitachi，Dionex等主流品牌机器，但优先选取可以进行自动衍生 的Agilent1260Infinity；所述色谱柱包括但不局限于Agilent，Waters，Hitachi，Thermo等主 流色谱柱，但优先选取AgilentZORBAXSB-Aq，5μm，4.6×250mmC18柱；所述色谱柱为C18 反相色谱柱，包括但不局限于250mm，150mm两种柱长规格，但优先选取250mm规格； 所述检测器包括但不局限于Agilent，Waters，Hitachi，Dionex等主流品牌检测器；所述流 速可以控制在0.8-2.0ml/min，但优先选取1.0ml/min；所述柱温可以控制在30-50℃，但优 先选取40℃；所述检测波长Ex控制在350-400nm，Em控制在420-480nm，但优先选取Ex 为338nm，Em为450nm；所述运行时间与进样量随实际情况可灵活调整。

3.根据权利要求1所述的一种同时检测微生物酶法产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺反应体系中五 种物质的高效液相检测方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述标准品溶液，L-丙氨酰-L- 谷氨酰胺与L-丙氨酰甲酯的浓度为0.08-0.4mM，优先选取0.2mM；L-谷氨酰胺的浓度为 0.04-0.2mM，优先选取0.1mM；L-谷氨酸的浓度为0.04-0.2mM，优先选取0.1mM；L-丙氨酰 -L-丙氨酸浓度为0.08-0.4mM，优先选取0.2mM。