[发明专利]一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株及构建及发酵方法有效
| 申请号： | 201511014766.6 | 申请日： | 2015-12-29 |
| 公开（公告）号： | CN105483071B | 公开（公告）日： | 2018-11-09 |
| 发明（设计）人： | 陈涛;刘双;康培;王智文;赵学明 | 申请（专利权）人： | 天津大学 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12P25/00;C12R1/19 |
| 代理公司： | 天津市北洋有限责任专利代理事务所 12201 | 代理人： | 陆艺 |
| 地址： | 300072*** | 国省代码： | 天津;12 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株及构建及发酵方法，构建方法为：(1)获得rib‐int段：(2)构建pLR 01质粒：(3)构建EC‑rib 01菌株：(4)构建EC‑Rib 02菌株：敲除步骤(3)所获得的菌株EC‑Rib 01基因组的糖酵解途径中的pfkA基因和ED途径中的edd基因及eda基因，得到菌株命名为EC‑Rib 02。本发明的一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC‑Rib 02核黄素产量达到10.47g/L以上，是目前大肠杆菌生产核黄素的最高产量；本发明的EC‑Rib 02菌株的生产周期为60‑80h，比现有常用的核黄素工程菌株生产周期短，节省能源。 | ||
| 搜索关键词： | 核黄素 构建 菌株 大肠杆菌工程菌 生产周期 高产 发酵 大肠杆菌 糖酵解途径 工程菌株 基因组 基因 敲除 质粒 能源 生产 | ||
【主权项】：
1.一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC‑Rib 02的构建方法，其特征是包括如下步骤：(1)获得rib‑int段：以SEQ ID No.4所示rib‑F和以SEQ ID No.5所示rib‑R为引物，以p20C‑EC10为模板，通过PCR的方法，得到以SEQ ID No.1所示rib‑int片段；(2)构建pLR 01质粒：以SEQ ID No.6所示Cat‑F和以SEQ ID No.7所示Cat‑R为引物，以pCas9为模板，通过PCR扩增，得到氯霉素乙酰转移酶基因，将氯霉素乙酰转移酶基因命名为Cat基因，通过CEPC组装技术，将Cat基因和来自于pTKRed质粒上的pSC101复制子组装成质粒pRB 01；将步骤(1)获得的rib‑int片段通过酶切连接的方法，连接到pRB 01质粒上面，得到质粒命名为pLR 01；(3)构建EC‑rib 01菌株：将步骤(2)获得的pLR 01质粒转入大肠杆菌E.coli MG1655，得到菌株EC‑Rib 01；(4)构建EC‑Rib 02菌株：敲除步骤(3)所获得的菌株EC‑Rib 01基因组的糖酵解途径中的pfkA基因和ED途径中的edd基因及eda基因，得到菌株命名为EC‑Rib 02。
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