[发明专利]一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株及构建及发酵方法

权利要求书

1.一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的构建方法，其特征是包括如下步骤：

(1)获得rib-int段：

以SEQ ID No.4所示rib-F和以SEQ ID No.5所示rib-R为引物，以p20C-EC10为模板，通过PCR的方法，得到以SEQ ID No.1所示rib-int片段；

(2)构建pLR 01质粒：

以SEQ ID No.6所示Cat-F和以SEQ ID No.7所示Cat-R为引物，以pCas9为模板，通过PCR扩增，得到氯霉素乙酰转移酶基因，将氯霉素乙酰转移酶基因命名为Cat基因，通过CEPC组装技术，将Cat基因和来自于pTKRed质粒上的pSC101复制子组装成质粒pRB 01；将步骤(1)获得的rib-int片段通过酶切连接的方法，连接到pRB 01质粒上面，得到质粒命名为pLR01；

(3)构建EC-rib 01菌株：

将步骤(2)获得的pLR 01质粒转入大肠杆菌E.coli MG1655，得到菌株EC-Rib 01；

(4)构建EC-Rib 02菌株：

敲除步骤(3)所获得的菌株EC-Rib 01基因组的糖酵解途径中的pfkA基因和ED途径中的edd基因及eda基因，得到菌株命名为EC-Rib 02。

2.权利要求1所述的方法构建的高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02。

3.一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02的发酵方法，其特征是包括如下述步骤：

(1)活化菌株：将权利要求2所述的高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02在LB固体培养基中划线，37℃培养10-20h，使菌株复壮；

(2)种子液的培养：将步骤(1)获得的活化菌接种到LB液体培养基中，32-37℃，180-240rpm培养10-20h，然后将所得菌液按照体积比为1％-10％的接种量接种到发酵培养基中，32-37℃，180-240rpm培养10-20h，得到种子液；

(3)发酵罐发酵：将步骤(2)所获得的种子液按照体积比为1％-10％的比例接种到装有2-3L发酵培养基的5L发酵罐中，加入氯霉素，使浓度为5-40ug/L，在35-37℃，pH＝6.5-7.3，搅拌转速300-800rpm的条件下发酵，当培养基中葡萄糖浓度降到2g/L以下时，采用连续补料的方式补充补料培养基；补料速度为0.1-0.5ml/min，当溶氧水平降至10％以下时，增加发酵罐的压力至0.02-0.1MPa；当发酵液中的核黄素浓度不再增加时，停止发酵；

所述发酵培养基是以每1L计含有：葡萄糖5-30g，酵母抽提物1-15g，硫酸铵0.5-5g，硫酸镁0.05-1g，磷酸氢二钠1-10g，磷酸二氢钾1-10g，尿素1-10g，柠檬酸铁铵10-100mg，氯化钙10-100mg，硫酸锌0.01-0.1mg，氯化锰0.01-0.1mg，硼酸0.01-0.1mg，氯化钴0.01-0.1mg，硫酸铜0.01-0.1mg，氯化镍0.01-0.1mg，钼酸钠0.01-0.1mg，余量为水；

所述补料培养基是以每1L计含有：葡萄糖500-800g，酵母抽提物5-20g，硫酸铵1-10g，硫酸镁0.1-5g，磷酸氢二钠2-5g，磷酸二氢钾2-15g，柠檬酸铁铵10-100mg，氯化钙10-100mg，硫酸锌0.01-0.1mg，氯化锰0.01-0.1mg，硼酸0.01-0.1mg，氯化钴0.01-0.1mg，硫酸铜0.01-0.1mg，氯化镍0.01-0.1mg，钼酸钠0.01-0.1mg，余量为水。

4.权利要求2所述的高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-Rib 02发酵生产核黄素的用途。