[发明专利]一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株及构建及发酵方法

说明书

本发明公开了一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株及构建及发酵方法，构建方法为：(1)获得rib‐int段：(2)构建pLR 01质粒：(3)构建EC‑rib 01菌株：(4)构建EC‑Rib 02菌株：敲除步骤(3)所获得的菌株EC‑Rib 01基因组的糖酵解途径中的pfkA基因和ED途径中的edd基因及eda基因，得到菌株命名为EC‑Rib 02。本发明的一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC‑Rib 02核黄素产量达到10.47g/L以上，是目前大肠杆菌生产核黄素的最高产量；本发明的EC‑Rib 02菌株的生产周期为60‑80h，比现有常用的核黄素工程菌株生产周期短，节省能源。

技术领域

本发明属于生物工程技术与应用和发酵工程领域，具体地涉及一种生产核黄素的大肠杆菌菌株及构建方法及发酵技术。

背景技术

核黄素，又称维生素B₂，是一种黄色的天然水溶性B族维生素。其分子式为C₁₇H₂₀O₆N₄，分子量为376，是人体必需的13种维生素之一。核黄素是机体内许多酶系统的重要辅基－黄素腺嘌呤二核甘酸(FAD)与黄素单核甘酸(FMN)的合成的前体物质。作为黄素蛋白的辅酶参与传递氢的有关代谢，在呼吸和生物氧化中起着重要的作用，是生命活动中不可缺少的维生素，是维持人和动物机体正常物质代谢所必须的营养物质。

核黄素已经广泛用于饲料、食品和医药领域。核黄素能促进蛋白质、脂肪、碳水化合物的代谢，具有维护皮肤和粘膜的生理功能。若机体缺乏核黄素，就会影响生物氧化作用，引起物质代谢紊乱，出现一系列病症，严重时会引起死亡。它作为常用临床药物，用于辅助治疗口角炎、眼角膜炎、白内障、眼角膜及口角血管增生等多种疾病。

核黄素主要生产方法为化学半合成法和微生物发酵法，其中，半合成法生产核黄素以D‐核糖为原料，纯度较高，但得率只有60％左右，原料浪费较大，而微生物发酵法生产核黄素则具有生产工艺简单、原料廉价、对环境无污染等优点，且只需要一步，目前已成为核黄素生产的主要方法。

用于核黄素发酵生产的菌株主要有酵母和基因工程菌两大类。1940年，利用阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)发酵生产核黄素首次获得了成功，产量为500微克/毫升；1946年，利用棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)也实现了在发酵液中积累少量的核黄素；1947年，以碎麦芽或乳清为原料，丙酮丁醇梭状杆菌(Clostridium acetobutylicum)发酵法被首次应用于商业化生产核黄素。利用真菌进行核黄素生产存在着诸如发酵周期过长、原料成分配比复杂、需加入不饱和脂肪酸来促进核黄素的产量等缺点。随着基因工程技术的发展，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和产氨棒状杆菌(Corynebactia aminogensis)等产核黄素工程菌相继构建成功，这些工程菌具有发酵周期短(2～3天)、原料要求简单、产量高等优点，在核黄素的微生物发酵生产中显示了强大的生命力。特别是相继构建成功的Bacillus subtilis等产核黄素工程菌，最高报道在三天时间内可达到20～27g/L。

目前生产上应用的产核黄素枯草芽孢杆菌多为通过多轮理化诱变之后筛选到的，由于随机诱变引入突变点的不确定性，这些生产菌株往往具有比较复杂的遗传背景，使得通过代谢工程进一步合理改进这些工业菌株面临着较大的挑战和困难。同时，大量未知突变的存在也使得对进一步合理改进的解释和评估变得更为复杂了。另外，由于诱变的随机性，这些高产菌株在逐渐积累和目标产品高产相关的正突变的过程中也不可避免的积累了一些不利突变点以及一些与目标表型无关的突变点。同野生菌株相比，它们大都在菌体生长速度、底物利用种类、对不利环境的耐受性或遗传稳定性等方面存在缺陷。由于和这些不良性状相关的基因型通常非常复杂，通过代谢工程方法消除这些不良性状也面临着很大的困难。

大肠杆菌作为一种重要的模式菌株，对其生理生化特性及遗传背景已经有了比较深入的了解，相关的分子生物学方法和基因操作技术都比较成熟，有利于通过代谢工程及合成生物学的合理设计来改进菌种。