[发明专利]一种检测肿瘤组织中EGFRvIII的方法

摘要

本发明公开了一种检测肿瘤组织中EGFRvIII的方法，该方法是把需检测目的基因序列，先利用编写的序列分析程序进行序列扫描，引物筛选，以设计得到巢式PCR引物，然后进行肿瘤组织RNA提取和cDNA获得，最后采用巢式PCR的方法进行连续两轮PCR扩增后再对扩增产物进行测序，通过序列分析对结果进行验证。本发明可以在短时间内灵敏检测出恶性肿瘤组织中EGFRvIII的存在，为靶向治疗提供良好前提和基础；采用巢式PCR方法，通过两轮PCR扩增放大基因表达信号，使观察结果更简单，进一步提高方法适用性；扩增产物具有特异性，确保PCR检测高准确度和灵敏度。

主权项

一种检测肿瘤组织中EGFRvIII的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）对EGFR，EGFRvIII基因序列进行分析：采用编写的序列分析程序对突变区之前的基因序列进行逐个碱基扫描，得到56‑70位碱基的低重复性区域；2）针对突变区前的低重复区域设计出两条特异性的正向引物，利用序列分析软件进行特异性反向引物设计，并与突变区之前的正向引物所匹配，分别设计出跨突变区的第一轮和第二轮特异性扩增引物；3）检测模板的获得，包括以下步骤：3.1）组织样品RNA的提取：取适量RNAlater保存的组织样品，提取组织样品RNA；3.2）获得模板cDNA：以组织样品RNA为模板，oligo dT为引物进行RNA的反转录得到组织样品cDNA；4）EGFRvIII的检测，包括以下步骤：4.1）以步骤3）获得的cDNA为模板，以水为阴性对照，设置空白对照，阳性对照，进行第一轮扩增；以第一轮PCR产物为模板，进行第二轮PCR扩增；以及4.2）1% 琼脂糖凝胶直接检测两轮PCR扩增情况，并根据EGFRvIII目的片段较EGFR野生型小801bp，直观地观察EGFRvIII的组织表达情况；以及5）检测结果的测序验证：切胶回收EGFRvIII目的片段，基因测序验证巢式PCR检测结果。