[发明专利]一种同步检测猪羊牛动物源性成分的微滴PCR引物体系及检测方法

摘要

一种同步检测猪羊牛动物源性成分的微滴PCR引物体系及检测方法，包括如下步骤：以样品总DNA为模板，利用所述引物对I、引物对II和引物对III组成的微滴PCR引物体系进行微滴PCR扩增实验，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果。其中，所述样品总DNA模板为猪、羊、牛物种肉产品中的一种以上。本发明公开了一种快速、准确、灵敏的微滴PCR同步检测3种动物源性成分的方法，能有效缩短实验时间，大大提高效率，且节省成本，从而有效鉴定猪羊牛制品的真伪及掺假情况。此外，本发明设计的微滴PCR引物体系配合相关试剂制成试剂盒，方便使用，同时为工业化生产及应用提供了可能。

主权项

1.一种同步检测猪羊牛动物源性成分的微滴PCR检测方法，其包括如下步骤：1)以待检样品总DNA为模板，配制含有微滴PCR引物体系的PCR水相体系和PCR油乳化剂体系，将PCR水相体系和PCR油乳化剂体系混合制备水包油的微滴PCR体系，进行微滴PCR扩增；其中，所述待检样品总DNA模板来自猪、羊、牛物种肉产品中的一种或多种；所述微滴PCR引物体系包括如下猪特异性引物对I、羊特异性引物对II和牛特异性引物对III：a)对猪12SrRNA基因进行扩增生成猪特异性扩增片段的猪特异性引物对I：正向引物：5’‑CTACATAAGATATCCACCACA‑3’；反向引物：5’‑ACATTGTGGATCTTCTAGGT‑3’；b)对羊细胞色素c氧化酶亚基III基因进行扩增生成羊特异性扩增片段的羊特异性引物对II：正向引物：5’‑TACACTGTACAGGCATCAG‑3’；反向引物：5’‑CGTGAAGTAGTAGGAGAGTA‑3’；c)对牛TNFRSF10A基因进行扩增生成羊特异性扩增片段的牛特异性引物对III：正向引物：5’‑CAGTGAGACTCAGCCTAGAGT‑3’；反向引物：5’‑CTGCTCCTAGATCAGTGGA‑3’；所述水包油的微滴PCR体系的制备方法：在磁力旋转下，将PCR水相体系以20‑35μl/s的速度加入到PCR油乳化剂体系中，混匀，静置，形成均匀的水油乳化剂，其中，PCR油乳化剂体系与PCR水相体系的体积比为1.5～2.5：1；所述水包油的微滴PCR体系的反应程序为：依次进行90‑100℃下预变性5‑20min，90‑100℃变性20‑60s，50‑60℃退火30‑60s，71‑73℃延伸60‑120s，进行30‑50次循环，71‑73℃下延伸5‑20min，最后在4‑20℃下保持＞1min后结束；2)反应结束后，将微滴PCR产物高速离心，水相油相分离，取下层水相的扩增产物进行电泳，根据琼脂糖凝胶电泳进行判定；3)结果判定：待检样品扩增出290bp条带的，判定待检样品为猪源性成分；待检样品扩增出370bp条带的，判定待检样品为羊源性成分；待检样品扩增出190bp条带的，判定待检样品为牛源性成分。