[发明专利]一种黄绿蜜环菌子实体抗肝癌活性甾醇类组分的制备方法

摘要

本发明公开了一种黄绿蜜环菌子实体抗肝癌活性甾醇类化合物的制备方法，发明工艺简单、回收率高、重复性较好、质量稳定可控，而且发明以细胞生长曲线为基本指标判定标准化组分和样品对贴壁、繁殖等细胞生理活性的影响，结果直观、易判断；所得到的黄绿蜜环菌子实体抗肝癌活性组分经进一步分离和结晶处理及NMR碳谱、氢谱分析，判定含有麦角甾醇和5α‑ergosta‑7,22‑dien‑3β‑ol。

主权项

1.一种黄绿蜜环菌子实体抗肝癌活性甾醇类组分的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：⑴黄绿蜜环菌丙酮提取物，按1g:50mL～100mL的固液比用甲醇进行溶解，过滤得到滤液，该滤液上微孔树脂柱分离，用3～5倍柱体积的90％～100％的甲醇溶液洗脱，收集该洗脱物并经减压干燥，即得黄绿蜜环菌子实体甾醇类组分；⑵所述黄绿蜜环菌子实体甾醇类组分中加入其体积10～20倍正己烷‑乙酸乙酯混合液进行溶解，溶解后过0.45μm的有机滤膜，得到含黄绿蜜环菌子实体甾醇类组分的样品溶液；所述含黄绿蜜环菌子实体甾醇类组分的样品溶液在以10μm硅胶为分离基质的制备色谱上分离并经减压干燥，即得Fr1、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5共5个组分样品，所述5个组分样品的分离参见图1所示的色谱分离图；⑶将所述5个组分样品采用iCelligence实时无标记细胞分析仪按下述步骤进行体外抗肝癌细胞模型筛选：①确认iCelligence测试系统正确连接，37℃、5％CO₂培养箱工作正常；②8孔细胞板内按150μL/孔加入培养基，室温放置15分钟后置于iCelligence测试台上测基线；所述培养基是指含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基；③将所述5个组分样品中的每个组分样品用DMSO配制成浓度为5mg/mL的样品溶液；④将对数生长期的人肝癌细胞HepG2，用胰酶按常规方法消化后，以950rpm的速率离心5min，将细胞重悬于所述培养基中，并将细胞浓度调至2.85×10⁴个/mL，得到对数生长期的人肝癌细胞HepG2悬液，并按345μL/孔、每孔10000个细胞的量将所述对数生长期的人肝癌细胞HepG2悬液接种入所述8孔细胞板的相应孔中，室温放置30min；⑤将所述5个组分样品分两批按每孔加5μL所述浓度为5mg/mL的样品溶液、每孔加345μL所述对数生长期的人肝癌细胞HepG2悬液的量接种入所述8孔细胞板的相应孔中，并置于所述iCelligence测试台，放入所述培养箱中开始检测；45h后得到两张黄绿蜜环菌子实体抗肝癌标准化组分的活性检测图；其中纵坐标为细胞指数，横坐标为实时细胞增殖动态效应；⑥根据所述两张黄绿蜜环菌子实体抗肝癌标准化组分的活性检测图，当细胞增殖曲线呈现上升平缓或不上升的趋势，则说明细胞分裂减缓或停止，即细胞不能进行正常的分裂，从而确定第4号组分具有体外抑制人肝癌细胞贴壁及增殖活性；其中，所述步骤⑴和所述步骤⑵中减压浓缩的条件是指真空度为0.06～0.09MPa，温度为50～70℃；所述步骤⑴中微孔树脂柱是指MCI型树脂柱；所述步骤⑵中正己烷‑乙酸乙酯混合液是指正己烷与乙酸乙酯按1mL：0.2mL～1mL的比例混合的溶液；所述步骤⑵中制备色谱分离的条件是指色谱柱尺寸为250×50mm；采用A为正己烷、B为乙酸乙酯的二元流动相体系进行分离：0～45min，88％A～88％A；检测波长为260nm；上样量为1.0g。