[发明专利]一种黄绿蜜环菌子实体抗肝癌活性甾醇类组分的制备方法

说明书

本发明公开了一种黄绿蜜环菌子实体抗肝癌活性甾醇类化合物的制备方法，发明工艺简单、回收率高、重复性较好、质量稳定可控，而且发明以细胞生长曲线为基本指标判定标准化组分和样品对贴壁、繁殖等细胞生理活性的影响，结果直观、易判断；所得到的黄绿蜜环菌子实体抗肝癌活性组分经进一步分离和结晶处理及NMR碳谱、氢谱分析，判定含有麦角甾醇和5α‑ergosta‑7,22‑dien‑3β‑ol。

技术领域

本发明涉及药物化学及生物医药技术领域，尤其涉及一种黄绿蜜环菌子实体抗肝癌

活性甾醇类组分的制备方法及其应用。

背景技术

肝癌细胞(hepatocellular carcinoma,HCC,以下简称肝癌)是一种恶性程度高、预后凶险的肿瘤，5年生存率只有7％左右，是全球第五位最常见的恶性肿瘤，在全世界肿瘤患者的致死率中高居第三位。我国肝癌发病人数约占全球的半数以上，发病年龄趋于年轻化。目前我国肝癌年死亡率为20/10万左右，位居我国各种恶性肿瘤死亡率的第2位，并且近10年来一直呈上升趋势。肝癌已经成为严重威胁我国人民健康和生命的一大杀手，其危险性不容忽视。

研究表明，一些中药复方或单味药的有效成分能诱导肿瘤细胞凋亡，其抗癌疗效与中药诱导肿瘤细胞凋亡有关。黄绿蜜环菌子实体是生长于青藏高原的珍稀野生食药用菌。目前有限的研究表明，黄绿蜜环菌子实体中含有较丰富的蛋白质、氨基酸、糖类、生物碱和少量有机酸、黄酮、强心苷、甾体三萜类、苷类、皂苷、挥发油、香豆素萜类、鞣质、酚类化合物等，该类化合物具有抗流感、防治神经炎、脚气病、促进儿童发育、抗氧化及抗肿瘤等生物活性。

中国专利申请CN 103494843A《黄绿蜜环菌子实体标准化组分制法及其在肺癌治疗中的应用》和CN 103494843A涉及了黄绿蜜环菌子实体标准化组分的制备方法及其在肺癌和肝癌中的应用，并未明确组分中的具体化学成分。文献中对黄绿蜜环菌子实体化学成分的研究同样极度匮乏。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺简单、易于实施的一种黄绿蜜环菌子实体抗肝癌活性甾醇类组分的制备方法。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供该黄绿蜜环菌活性甾醇类组分在肝癌治疗中的应用。

为解决上述问题，本发明所述的一种黄绿蜜环菌子实体抗肝癌活性甾醇类组分的制备方法，包括以下步骤：

⑴黄绿蜜环菌丙酮提取物，按1g:50mL～100mL的固液比用甲醇进行溶解，过滤得到滤液，该滤液上微孔树脂柱分离，用3～5倍柱体积的90％～100％的甲醇溶液洗脱，收集该洗脱物并经减压干燥，即得黄绿蜜环菌子实体甾醇类组分；

⑵所述黄绿蜜环菌子实体甾醇类组分中加入其体积10～20倍正己烷-乙酸乙酯混合液进行溶解，溶解后过0.45μm的有机滤膜，得到含黄绿蜜环菌子实体甾醇类组分的样品溶液；所述含黄绿蜜环菌子实体甾醇类组分的样品溶液在以10μm硅胶为分离基质的制备色谱上分离并经减压干燥，即得Fr1、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5共5个组分样品；

⑶将所述5个组分样品采用iCelligence实时无标记细胞分析仪按下述步骤进行体外抗肝癌细胞模型筛选：

①确认iCelligence测试系统正确连接，37℃、5％CO₂培养箱工作正常；

②8孔细胞板内按150μL/孔加入培养基，室温放置15分钟后置于iCelligence测试台上测基线；所述培养基是指含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基；

③将所述5个组分样品中的每个组分样品用DMSO配制成浓度为5mg/mL的样品溶液；