[发明专利]一种确定大豆球蛋白碱性多肽抑菌机制的方法

摘要

本发明公开了一种确定大豆球蛋白碱性多肽抑菌机制的方法，属于多肽物质抑菌机理领域。由于抗菌肽结构复杂，作用机制多样，关于大豆球蛋白碱性多肽的抑菌机制属于膜损伤机制还是膜内物质损失机制，目前还没有被阐明。本发明通过测量细菌细胞内金属离子的泄露，细胞内、外膜的渗透性，对大豆球蛋白碱性多肽的膜损伤机制进行了确定。

主权项

1.一种确定大豆球蛋白碱性多肽抑菌机制的方法，其特征在于，步骤为：A.检测大豆球蛋白碱性多肽对微生物细胞离子泄露的影响情况；B.检测大豆球蛋白碱性多肽对微生物细胞外膜渗透性的影响情况；C.检测大豆球蛋白碱性多肽对微生物细胞内膜渗透性的影响情况；D.结果判定：若大豆球蛋白碱性多肽促进微生物细胞离子泄露、大豆球蛋白碱性多肽促使细胞外膜渗透性增强、大豆球蛋白碱性多肽促使细胞内膜渗透性增强，则大豆球蛋白碱性多肽的抑菌机制为膜损伤机制；反之为膜内物质损伤机制；步骤A、B、C、D所述微生物为大肠杆菌；步骤A具体包括：1）将对数生长期108‑109cfu/ml的大肠杆菌菌液离心，收集菌体；将所收集的菌体重悬于0.8‑0.9%的无菌生理盐水中，并将菌悬液平均分成两组；2）向步骤1）两组菌悬液中的一组中加入大豆球蛋白碱性多肽溶液，设为实验组,使大豆球蛋白碱性多肽的终浓度为300‑500μg/ml；另一组中加入等量纯净水，设为对照组；3）将步骤2）两组样品在36‑38℃恒温振荡培养，每隔半小时从两组样品中各自取出菌液，离心收集上清液；4）将步骤3）所收集的上清液置于消化杯中，再分别加入浓硝酸和高氯酸85‑95℃水浴加热，重复多次，直到剩余液体颜色透明为止；5）将两组步骤4）所得透明液体分别用纯净水定容，用电感耦合等离子体发射光谱仪分别测定各组中Ca2+、K+、Mg2+的浓度变化；步骤B具体包括：1） 将红霉素稀释至0.7、1.5、3、6、25、100μg/ml，将利福平稀释至0.6、1.25、2.5、5、10、20μg/ml；2）将步骤1）所配制不同浓度的红霉素分别与大肠杆菌菌液和大豆球蛋白碱性多肽混合均匀，作为实验组一；步骤1）所配制不同浓度的利福平分别与大肠杆菌菌液和大豆球蛋白碱性多肽混合均匀，作为实验组二；3）将步骤1）所配制不同浓度的红霉素分别与大肠杆菌菌液和无菌水混合，作为对照组一；将步骤1）所配制不同浓度的利福平分别与大肠杆菌菌液和无菌水混合，作为对照组二；4）将实验组一、实验组二、对照组一、对照组二四组溶液在36‑38℃恒温培养3‑7h后，检测其吸光度，吸光度的测定波长为600nm；步骤C具体包括：1）将对数生长期108‑109cfu/ml的大肠杆菌菌液离心，收集菌体；将所收集的菌体重悬于M9乳糖诱导培养基中；2）将步骤1）所得菌悬液36‑38℃振荡培养8‑12h后，离心收集菌体，并将菌体重悬于β‑半乳糖苷酶反应缓冲液中；3）将大豆球蛋白碱性多肽配制成浓度为50、100、200、400μg/ml的溶液；4）将步骤2）所得菌悬液分别与邻硝基苯‑β‑D‑吡喃半乳糖苷以及步骤3）所述不同浓度的大豆球蛋白碱性多肽溶液混合，36‑38℃持续水浴；5）每隔30min，测定步骤4）各溶液的吸光度。