[发明专利]一种评价人口腔黏膜细胞基因组稳定性的方法

摘要

本发明公开一种评价人口腔黏膜细胞基因组稳定性的方法，属于细胞遗传及分子生物技术领域；本方法通过取少量口腔黏膜细胞样本，制备成单细胞悬液，进行细胞计数，分析个体口腔黏膜细胞中的(1)细胞增殖状态和死亡生物标记，包括基底细胞(basal cells，BS)、分化细胞(differentiated cells,DF)、核固缩(Pyknotic，PN)、染色质凝聚(Condensed chromatin，CC)、核破裂(Karyorrhexis，KH)、核溶解(Karyolytic，KL)、双核(binuclear,BN)及(2)遗传损伤标志：微核(micronucleus，MN)、核芽(nuclear bud，NBud)等的发生率，综合评估个体细胞的生长状况和遗传损伤水平，结合个体的饮食和生活方式、年龄及其健康史，进行微营养素和生活方式的干预，降低个体基因组损伤，提高基因组稳定性，进而降低遗传-环境相关疾病的患病风险。

主权项

一种评价人口腔黏膜细胞基因组稳定性的方法，其特征在于：该方法是通过取少量的口腔黏膜细胞样本，制备成单细胞悬液，进行细胞计数，进而对个体的基因组损伤状况的评估，给予一定的干预意见，维护个体基因组稳定状态，具体包括如下步骤：a.口腔黏膜细胞缓冲液的配制：称取1.21g三羟甲基氨基甲烷Tris，37.2g EDTA‑二钠，1.2g NaCl，7.2g NaOH完全溶解，用浓盐酸调PH至7.0，定容后，121℃高压灭菌30min，室温密封保存；b.口腔黏膜细胞的采集：(1)取材前，志愿者先用饮用水洗漱口腔2‑3遍，以清除杂物、确保口腔内部清洁；(2)用带柄的小木片在脸颊内侧轻轻刮取黏膜细胞，并将其充分悬浮于装有5‑8mL细胞缓冲液的烧杯中得细胞悬浮液；c.单细胞悬液的制备：(1)将细胞悬浮液转入10mL离心管中，581g离心10min；(2)弃上清，用5mL缓冲液重新悬浮细胞，581g离心10min；(3)弃上清，再用3mL缓冲液悬浮细胞，用组织匀浆器匀浆3min后，经150目的钢网过滤，将滤液转入干净的离心管中，100g离心10min；(4)弃上清，用400μl缓冲液悬浮细胞，通过血球计数板计数，调整细胞浓度至80,000个/mL；d.细胞涂片及染色镜检：(1)向制好的单细胞悬液中加入二甲亚砜DMSO作用8‑10min；(2)以每孔100‑120μl悬液加入细胞涂片离心机的小孔，以52g离心5min；(4)待装片自然风干，卡诺氏固定液固定10min；(5)自然风干后，吉姆萨母液稀释后染色15min，分别用自来水、蒸馏水水洗，显微镜下观察，视颜色深浅酌情复染；(6)自然晾干10min，用0.2％的亮绿染色20‑30s，分别用自来水、蒸馏水涮洗；(7)待2h后用中性树脂封片保存，每个样本制备3张装片为宜；e.细胞计数：在光学显微镜100×下计数1000个细胞中基底细胞BS、分化细胞DF、双核BN、染色质凝聚CC、核固缩PN、核破裂KH、核溶解KL的数目，以及2000个正常的BS和DF中微核MN、核芽NBud的数目；至少2人重复计数后误差在30％以内数据可用；每个个体各指标的频率以千分率计算，以确保本评价方法的准确性；f.人口腔黏膜基因组健康分析：通过计数，以对个体口腔黏膜细胞中的微核MN、核芽NBud的发生率进行评估为基础，结合个体的饮食和生活方式、年龄及其健康史，进行微营养素和生活方式的干预，达到降低基因组损伤，提高基因组稳定性，进而减少遗传‑环境相关疾病风险的目标。