[发明专利]ATP硫酸化酶的生物素标记方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及ATP硫酸化酶的生物素标记方法。步骤包括透析ATP硫酸化酶，活化生物素，透析生物素化的ATP硫酸化酶，纯化，测定蛋白和冷藏。在测序反应中，生物素化的ATP硫酸化酶可与焦磷酸酶和荧光素酶协同作用，进行通量高、读长大的测序反应。

主权项

1.一种ATP硫酸化酶的生物素标记方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）使用pH值为8.0的PBS缓冲液溶解ATP硫酸化酶；（2）使用pH值为8.0的PBS缓冲液对ATP硫酸化酶进行透析；（3）活化生物素：将生物素、EDC和NHS加入二甲基甲酰胺中，生物素、EDC和NHS的摩尔比为4:5:4，二甲基甲酰胺的纯度为分析纯以上；（4）平衡生物素至10℃以下；（5）将活化的生物素溶于二甲基甲酰胺和四氢呋喃混合溶剂中，加入ATP硫酸化酶，按照活化的生物素与ATP硫酸化酶摩尔比（22‑25）:1的比例混合，搅拌，得到混合溶液；（6）使用pH值为8.0的PBS缓冲液对混合溶液进行透析，去除杂质和游离生物素；（7）采用superdex 200进行分子排阻；（8）使用280nm的吸光度测定蛋白含量；（9）加入保护剂，冷藏保存至‑80℃—‑16℃；所述溶解ATP硫酸化酶，使ATP硫酸化酶浓度为1.5‑2mg/ml；所述搅拌温度为4℃，持续5小时以上；所述透析过程，PBS缓冲液体积为混合溶液的10倍以上，PBS缓冲液更换一次以上；所述保护剂含有PBS缓冲液；还含有甘氨酸、组氨酸、甘露醇、DTT、EDTA、叠氮钠和聚乙二醇中的一种或几种；制备得到的生物素化ATP硫酸化酶适合应用于焦磷酸测序反应中，在测序反应中，与焦磷酸酶和ATP硫化酶协同作用，进行通量高、读长大的测序反应。