[发明专利]一种针对乙型肝炎病毒多耐药位点的高通量检测方法

摘要

本发明提供了一种针对多样本多位点的乙型肝炎病毒多耐药位点检测方法，包括提取HBV基因组DNA、PCR扩增、PCR产物混合纯化、再次PCR扩增、文库质检定量、上机测序及数据分析等步骤。本发明的方法能够在同一个文库中同时检测分析多个HBV样品的多个耐药位点突变状态。使得通过高通量测序技术检测临床HBV病毒耐药突变成为可能，该流程具有起始样本量小、针对性强、成本低、通量高，准确性高等优点。

主权项

一种针对乙型肝炎病毒本身的多耐药位点的高通量检测方法，其是非诊断方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：提取检测对象各个样本中的HBV基因组DNA；步骤2：针对不同样本使用不同的PCR引物进行PCR扩增，所述步骤2的PCR扩增中使用的引物为针对乙型肝炎病毒基因组RT区域的多个耐药位点进行设计，所述乙型肝炎病毒基因组RT区域的多个耐药位点为选自V173L、L180M、M204V/I、A181T/V、N236T、S202G、M250V、T184G、I169T、A194T中的至少一种，所述引物是在上下游PCR引物的5’端分别加上3个碱基标签序列，其中，上游PCR引物序列是GACTCGTGGTGGACTTCTCTCA，下游PCR引物序列是GRGCAACGGGGTAAAGGK，所使用的标签序列如下表：步骤3：将步骤2中所得到不同样本的PCR产物按照相同的摩尔数混合，得到混合后的PCR产物；步骤4：将混合后的PCR产物使用通用引物进行第二次PCR扩增，其中PCR引物序列如下：5’‑AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT‑3’5’‑CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT‑3’，获得测序文库并进行文库质检定量；步骤5：上机测序及数据分析得到耐药位点相关信息。