[发明专利]携带MUC-1抗原基因的重组腺相关病毒载体及构建方法与应用

摘要

本发明公开了一种携带MUC‑1抗原基因的重组腺相关病毒载体及构建方法与应用。该rAAV是将腺相关病毒载体中在已经被删除的腺相关病毒结构基因位置处插入MUC‑1抗原基因得到。本发明的rAAV可将其携带的MUC‑1抗原基因输送入单核细胞‑树突状细胞系中，被用于刺激免疫系统的效应细胞。实验证明，被本发明的rAAV的病毒载体感染的DC所诱导的CTL在体外或患者体内可有效地抑制MUC‑1抗原阳性的恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞。本发明的重组腺相关病毒载体或其相关产品可被用于制备治疗多种MUC‑1抗原阳性肿瘤的药物。

主权项

1.一种携带MUC‑1抗原基因的重组腺相关病毒载体，其特征在于：是将腺相关病毒载体中的腺相关病毒的结构基因替换为MUC‑1抗原基因得到的重组腺相关病毒载体；所述重组腺相关病毒载体的构建方法包括如下步骤：1）改建AAV‑2型pBR322质粒：使用限制性内切酶Bst98 I和Hpa I将AAV‑2型pBR322质粒中的AAV‑2型腺相关病毒中的结构基因切除，然后将含有限制性内切酶EcoR I和EcoR V酶切位点的核苷酸序列 CGAATTCATGCGATATCGTT插入所述AAV‑2型pBR322质粒中，保留两端的TR序列或分别在两端完整的TR序列的第75位核苷酸序列处均插入9个核苷酸CTGCGCTGG组成的片段；2）将启动子插入步骤1）得到的改建的AAV‑2型pBR322质粒中，构建携带有启动子的AAV‑2型pBR322质粒；所述启动子为下述四种启动子中的一种：p5启动子、巨噬细胞病毒启动子、β‑肌动蛋白启动子和SV40早期启动子；3）获取MUC‑1 cDNA，包括以下步骤：31）从MUC‑1抗原阳性的肿瘤组织中提取总mRNA，由总mRNA进行逆转录反应，合成总cDNA；32）以所述总cDNA为模板，在引物1：GCCTGCCTGAATCTGTT和引物2：AACCTGAGTGGAGTGG的引导下进行PCR扩增，得到序列如SEQ ID NO:3所示的所述MUC‑1 cDNA；4）将步骤2）构建的所述携带有启动子的AAV‑2型pBR322质粒和步骤3）得到的MUC‑1 cDNA分别用限制性内切酶BamHI和PstI进行酶切，然后进行DNA连接反应，得到携带有所述启动子和MUC‑1抗原基因的重组腺相关病毒载体。