[发明专利]携带MUC-1抗原基因的重组腺相关病毒载体及构建方法与应用

权利要求书

1.一种携带MUC-1抗原基因的重组腺相关病毒载体，其特征在于：是将腺相关病毒载体中的腺相关病毒的结构基因替换为MUC-1抗原基因得到的重组腺相关病毒载体；所述重组腺相关病毒载体的构建方法包括如下步骤：

1）改建AAV-2型pBR322质粒：使用限制性内切酶Bst98 I和Hpa I将AAV-2型pBR322质粒中的AAV-2型腺相关病毒中的结构基因切除，然后将含有限制性内切酶EcoR I和EcoR V酶切位点的核苷酸序列 CGAATTCATGCGATATCGTT插入所述AAV-2型pBR322质粒中，保留两端的TR序列或分别在两端完整的TR序列的第75位核苷酸序列处均插入9个核苷酸CTGCGCTGG组成的片段；

2）将启动子插入步骤1）得到的改建的AAV-2型pBR322质粒中，构建携带有启动子的AAV-2型pBR322质粒；所述启动子为下述四种启动子中的一种：p5启动子、巨噬细胞病毒启动子、β-肌动蛋白启动子和SV40早期启动子；

3）获取MUC-1 cDNA，包括以下步骤：31）从MUC-1抗原阳性的肿瘤组织中提取总mRNA，由总mRNA进行逆转录反应，合成总cDNA；32）以所述总cDNA为模板，在引物1：GCCTGCCTGAATCTGTT和引物2：AACCTGAGTGGAGTGG的引导下进行PCR扩增，得到序列如SEQ IDNO:3所示的所述MUC-1 cDNA；

4）将步骤2）构建的所述携带有启动子的AAV-2型pBR322质粒和步骤3）得到的MUC-1cDNA分别用限制性内切酶BamHI和PstI进行酶切，然后进行DNA连接反应，得到携带有所述启动子和MUC-1抗原基因的重组腺相关病毒载体。

2.一种携带MUC-1抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法，其特征在于：将腺相关病毒载体中的腺相关病毒的结构基因剔除，然后在剔除的位置上插入MUC-1抗原基因，得到重组腺相关病毒载体；包括以下步骤：

1）改建AAV-2型pBR322质粒：使用限制性内切酶Bst98 I和Hpa I将AAV-2型pBR322质粒中的AAV-2型腺相关病毒中的结构基因切除，然后将含有限制性内切酶EcoR I和EcoR V酶切位点的核苷酸序列 CGAATTCATGCGATATCGTT插入所述AAV-2型pBR322质粒中，保留两端的TR序列或分别在两端完整的TR序列的第75位核苷酸序列处均插入9个核苷酸CTGCGCTGG组成的片段；

2）将启动子插入步骤1）得到的改建的AAV-2型pBR322质粒中，构建携带有启动子的AAV-2型pBR322质粒；所述启动子为下述四种启动子中的一种：p5启动子、巨噬细胞病毒启动子、β-肌动蛋白启动子和SV40早期启动子；

3）获取MUC-1 cDNA，包括以下步骤：31）从MUC-1抗原阳性的肿瘤组织中提取总mRNA，由总mRNA进行逆转录反应，合成总cDNA；32）以所述总cDNA为模板，在引物1：GCCTGCCTGAATCTGTT和引物2：AACCTGAGTGGAGTGG的引导下进行PCR扩增，得到序列如SEQ IDNO:3所示的所述MUC-1 cDNA；

4）将步骤2）构建的所述携带有启动子的AAV-2型pBR322质粒和步骤3）得到的MUC-1cDNA分别用限制性内切酶BamHI和PstI进行酶切，然后进行DNA连接反应，得到携带有所述启动子和MUC-1抗原基因的重组腺相关病毒载体。