[发明专利]金枪鱼鱼肉双向电泳蛋白质图谱的获取方法

摘要

本发明公开了一种金枪鱼鱼肉双向电泳蛋白质图谱的获取方法，依次进行以下步骤1)、金枪鱼鱼肉蛋白质提取及纯化，得蛋白提取液；2)、一向等电聚焦；3)、二向SDS‑PAGE电泳；4)、染色及图像分析。采用本发明方法对金枪鱼鱼肉蛋白进行分离，能获得较多的蛋白质点，重复性好，背景清晰，无横纵条纹现象，结果稳定。此发明适用于各种金枪鱼鱼肉蛋白双向电泳凝胶方法，为进一步对金枪鱼蛋白组学和分子生物学的研究奠定基础。

主权项

金枪鱼鱼肉双向电泳蛋白质图谱的获取方法，其特征是依次进行以下步骤：1)、金枪鱼鱼肉蛋白质提取及纯化，包括以下步骤：①、取干冰运输的金枪鱼鱼肉，置于‑70～‑90℃保存；②、称取步骤①所得的0.1g鱼肉作为样品放入液氮预冷后的研钵中，加液氮研磨成粉末状；③、在步骤②所得的粉末中加入750～850μL蛋白质裂解液，充分溶解粉末后离心，收集上清液Ⅰ；④、对步骤③所得的上清液Ⅰ进行超声处理，从而破碎核酸；离心，收集上清液Ⅱ，在上清液Ⅱ中加入3.5～4.5体积倍的丙酮后，于‑18～‑22℃沉淀10～14小时；然后离心，对去除上清液后的沉淀物干燥，得纯化的蛋白质团块；⑤、在步骤④所得的蛋白质团块中加入500～700μL蛋白质裂解液，超声助溶直至蛋白质团块溶解，离心，得蛋白提取液；2)、一向等电聚焦；取步骤1)所得的蛋白提取液，按上样量150μg用水化液稀释至460μL的上样体积，得样品液；将样品液加入等电聚焦盘中，再将pH4‑7、24cm的IPG胶条胶面向下放入盘中，除去胶面与样品液之间的气泡，加入6ml矿物油，覆盖胶条，进行一向等电聚焦；设定参数如下：上述水化液的配方为：在1ml的蛋白质裂解液中加入0.01g的二硫苏糖醇和10μL pH4‑7的IPG Buffer；所述蛋白质裂解液为：在每10ml水中加入70mmol的尿素、20mmol的硫脲、0.4g的3‑[(3‑胆固醇氨丙基)二甲基氨基]‑1‑丙磺酸、0.01mmol的苯甲基磺酰氟；3)、二向SDS‑PAGE电泳，包括以下步骤：①胶条平衡：向步骤2)所得的聚焦好后的胶条加入平衡液I，平衡12～17min，倒净平衡液I后加入平衡液II，避光平衡12～17min；平衡缓冲液母液为：在500ml 0.05mol/L、pH8.8的Tris‑HCl缓冲液中加入3mol的尿素、10g十二烷基磺酸钠、150ml的甘油、0.01g的溴酚蓝；平衡液I：在平衡缓冲液母液加入100mM的二硫苏糖醇；平衡液II：在平衡缓冲液母液加入250mM的碘乙酰胺；②SDS‑PAGE电泳：将步骤①所得的平衡好的胶条置于12.5％的SDS‑PAGE凝胶上，用琼脂糖封顶液封胶，加入电泳缓冲液进行二向电泳，设定参数如下：先用2w/胶，1h；再用17w/胶直至溴酚蓝跑出胶面；4)、染色及图像分析。