[发明专利]金枪鱼鱼肉双向电泳蛋白质图谱的获取方法

说明书

技术领域

本发明涉及了一种适用于金枪鱼双向电泳凝胶技术，属于生物技术领域。该技术可直接应用于各类金枪鱼蛋白质组学的研究。

背景技术

金枪鱼也称鲔鱼、吞拿鱼，属大洋性高度洄游鱼类。常见的金枪鱼类计有5个属，17个种，其中对渔业影响较大的主要品种是大眼金枪鱼、黄鳍金枪鱼、长鳍金枪鱼和鲣鱼4个种类，这4种金枪鱼产量从1998的382.6万吨增加到2008的430万吨。金枪鱼肉质柔嫩鲜美，富含多种蛋白质、氨基酸、脂肪等营养物质，是不可多得的健康美食，被世界营养学会推荐为三大营养鱼之一。

金枪鱼种类繁多，且价值差异较大，因此常有低值金枪鱼冒充高值金枪鱼的事件发生。利用基于双向电泳的蛋白质组学技术，可以通过不同品种潜在的特征性蛋白点(Target)来区别鱼种，从而对鱼种高效准确的鉴别，保证水产品质和安全。此外金枪鱼鱼肉品质影响着产品营养价值和经济价值，鱼肉鲜度是衡量金枪鱼品质好坏的重要指标。蛋白质是水产品肌肉中最重要的组分，在冷藏过程中鱼肉蛋白质降解引起水产品鲜度下降，尤其与鱼肉质构特性变化具有密切相关，是导致鱼肉品质变化最主要因素。利用差异蛋白质组学技术体系研究冷藏过程中金枪鱼肉鲜度变化机制，能够为控制鱼肉品质变化提供了一个新思路。目前利用双向电泳获得蛋白图谱的方法在水产品领域有一定程度的应用。而在金枪鱼应用方面几乎空白。

现有报道的“水产品双向电泳获得蛋白图谱的方法”主要为大黄鱼双向电泳方法建立，其主要步骤为用液氮研磨，加入裂解液裂解，离心后直接水化上样，然后依次进行等电聚焦和SDS-PAGE电泳，最后染色得到图谱。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种金枪鱼鱼肉双向电泳蛋白质图谱的获取方法，本发明是一种适用于金枪鱼的双向电泳凝胶技术，是针对金枪鱼鱼肉蛋白采用双向电泳技术制备，能获得较高质量的双向电泳图谱。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种金枪鱼鱼肉双向电泳蛋白质图谱的获取方法，依次进行以下步骤：

1)、金枪鱼鱼肉蛋白质提取及纯化；得蛋白提取液；

2)、一向等电聚焦；

取步骤1)所得的蛋白提取液，按上样量150μg用水化液稀释至460μL的上样体积，得样品液；

将样品液加入等电聚焦盘中，再将pH4-7、24cm的IPG胶条胶面向下放入盘中，除去胶面与样品液之间的气泡，加入6ml矿物油，覆盖胶条，进行一向等电聚焦；

设定参数如下：

上述水化液的配方为：在1ml的蛋白质裂解液中加入0.01g的二硫苏糖醇(DTT)和10μL的IPG Buffer(pH4-7)；

3)、二向SDS-PAGE电泳，包括以下步骤：

①胶条平衡：向步骤2)所得的聚焦好后的胶条加入平衡液I，平衡12～17min(较佳为15min)，倒净平衡液I后加入平衡液II，避光平衡12～17min(较佳为15min)；

备注说明：平衡液I、平衡液II的用量只需确保将胶条覆盖即可，第一处平衡不需要避光；

平衡缓冲液母液为：在500ml的Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L，pH8.8)中加入3mol的尿素、10g十二烷基磺酸钠(SDS)、150ml的甘油、0.01g的溴酚蓝；

平衡液I：在平衡缓冲液母液加入100mM的二硫苏糖醇(DTT)；

平衡液II：在平衡缓冲液母液加入250mM的碘乙酰胺；

②SDS-PAGE电泳：将步骤①所得的平衡好的胶条置于12.5％的SDS-PAGE凝胶上，用琼脂糖封顶液封胶，加入电泳缓冲液进行二向电泳，设定参数如下：

先用2w/胶，1h；再用17w/胶直至溴酚蓝跑出胶面；

4)、染色及图像分析。

作为本发明的金枪鱼鱼肉双向电泳蛋白质图谱的获取方法的改进：

所述步骤4)为：

将步骤3)所得的胶片进行银染或考马斯亮蓝显色后通过UMAX公司的PowerLook 2100XL-USB扫描分析仪获取图像，采用PD-Quest软件进行处理从而得金枪鱼双向电泳凝胶图谱。

作为本发明的金枪鱼鱼肉双向电泳蛋白质图谱的获取方法的进一步改进：

所述蛋白质裂解液为：在每10ml水中加入70mmol的尿素、20mmol的硫脲、0.4g的3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、0.01mmol的苯甲基磺酰氟。