[发明专利]金枪鱼鱼肉双向电泳蛋白质图谱的获取方法

权利要求书

1.金枪鱼鱼肉双向电泳蛋白质图谱的获取方法，其特征是依次进行以下步骤：

1)、金枪鱼鱼肉蛋白质提取及纯化，包括以下步骤：

①、取干冰运输的金枪鱼鱼肉，置于-70～-90℃保存；

②、称取步骤①所得的0.1g鱼肉作为样品放入液氮预冷后的研钵中，加液氮研磨成粉末状；

③、在步骤②所得的粉末中加入750～850μL蛋白质裂解液，充分溶解粉末后离心，收集上清液Ⅰ；

④、对步骤③所得的上清液Ⅰ进行超声处理，从而破碎核酸；离心，收集上清液Ⅱ，在上清液Ⅱ中加入3.5～4.5体积倍的丙酮后，于-18～-22℃沉淀10～14小时；然后离心，对去除上清液后的沉淀物干燥，得纯化的蛋白质团块；

⑤、在步骤④所得的蛋白质团块中加入500～700μL蛋白质裂解液，超声助溶直至蛋白质团块溶解，离心，得蛋白提取液；

2)、一向等电聚焦；

取步骤1)所得的蛋白提取液，按上样量150μg用水化液稀释至460μL的上样体积，得样品液；

将样品液加入等电聚焦盘中，再将pH4-7、24cm的IPG胶条胶面向下放入盘中，除去胶面与样品液之间的气泡，加入6ml矿物油，覆盖胶条，进行一向等电聚焦；

设定参数如下：

上述水化液的配方为：在1ml的蛋白质裂解液中加入0.01g的二硫苏糖醇和10μL pH4-7的IPG Buffer；

所述蛋白质裂解液为：在每10ml水中加入70mmol的尿素、20mmol的硫脲、0.4g的3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、0.01mmol的苯甲基磺酰氟；

3)、二向SDS-PAGE电泳，包括以下步骤：

①胶条平衡：向步骤2)所得的聚焦好后的胶条加入平衡液I，平衡12～17min，倒净平衡液I后加入平衡液II，避光平衡12～17min；

平衡缓冲液母液为：在500ml 0.05mol/L、pH8.8的Tris-HCl缓冲液中加入3mol的尿素、10g十二烷基磺酸钠、150ml的甘油、0.01g的溴酚蓝；

平衡液I：在平衡缓冲液母液加入100mM的二硫苏糖醇；

平衡液II：在平衡缓冲液母液加入250mM的碘乙酰胺；

②SDS-PAGE电泳：将步骤①所得的平衡好的胶条置于12.5％的SDS-PAGE凝胶上，用琼脂糖封顶液封胶，加入电泳缓冲液进行二向电泳，设定参数如下：

先用2w/胶，1h；再用17w/胶直至溴酚蓝跑出胶面；

4)、染色及图像分析。

2.根据权利要求1所述的金枪鱼鱼肉双向电泳蛋白质图谱的获取方法，其特征是：

所述步骤4)为：

将步骤3)所得的胶片进行银染或考马斯亮蓝显色后通过UMAX公司的PowerLook 2100XL-USB扫描分析仪获取图像，采用PD-Quest软件进行处理从而得金枪鱼双向电泳凝胶图谱。

3.根据权利要求2所述的金枪鱼鱼肉双向电泳蛋白质图谱的获取方法，其特征是：

所述步骤3)的步骤②中：

12.5％的SDS-PAGE凝胶为：在180ml的超纯水中加入220ml的30％丙烯酰胺储液、125ml 1.5mol/L、pH8.8的Tris-HCl缓冲液、5.3ml的10％十二烷基磺酸钠水溶液、2.1mL的10％过硫酸铵水溶液、138μL的N,N,N',N'-四甲基乙二胺；

上述30％丙烯酰胺储液为：在1000ml水中加入290g丙烯酰胺和10g N,N'-甲叉双丙烯酰胺。

4.根据权利要求3所述的金枪鱼鱼肉双向电泳蛋白质图谱的获取方法，其特征是：

所述步骤3)的步骤②中：

琼脂糖封顶液为：在每100ml水中加入0.8g低熔点琼脂糖、0.002g溴酚蓝；

电泳缓冲液为：在1L水中加入1g SDS、0.192mol的甘氨酸、25mmol的Tris-base。