[发明专利]一种全层皮肤模型的构建方法

摘要

本发明涉及一种全层皮肤模型的构建方法，该全层皮肤模型具有成纤维细胞组成的真皮层和表皮细胞组成的表皮层，可用于替代动物皮肤组织进行化妆品等的物质检测；本发明通过梯度时间进行真皮层细胞的接种，同时联合Vc的使用，促使真皮层的细胞大量分泌胶原并形成成熟的胞外基质，在细胞复层化的过程中胞外基质又为细胞提供了天然的三维支架和生长空间，提高了其生物活性和生物相容性；同时，通过多次借种与细胞增殖自身的复层化过程相结合，增加了真皮层的厚度、机械强度、稳定性；真皮层与表皮结合后，培养液能够满足真皮层和表皮层细胞的活性及生物学功能的发挥。

主权项

一种全层皮肤模型的构建方法，其特征在于：该全层皮肤模型无外源材料支架，具有成纤维细胞组成的真皮层和表皮细胞组成的表皮层；其构建方法，包括以下方法步骤：步骤一、成纤维细胞和表皮细胞的分离培养成纤维细胞分离培养：将已去除脂肪和结缔组织的1mm3的皮肤组织，置于含有胶原酶200U·ml‑1、透明质酸300U·ml‑1的培养液I中，放置4℃过夜；再加入等体积的消化液，37℃空气摇床180rpm 20min后终止消化；1000rpm离心10min收集细胞；用含培养液Ⅱ调整细胞密度每毫升2×105～4×105细胞接种，5％CO2、37℃条件下培养；表皮细胞的分离培养：将表皮组织浸没于1.2U/mL的消化液中，置入4℃条件下16～20h；在无菌条件下撕下表皮层，将表皮层放入37℃预热的消化液中，在37℃条件下，消化10min后终止：每2min震荡3下；无菌200目筛网过滤，800r/min离心6min后弃上清；加入37℃预热的PBS缓冲液，吹打至均匀后，再次800r/min离心6min后，弃上清：加入I培养液，吹打至均匀；按照3×104～5×104/cm2的密度接种，移入5％CO2、37℃条件下培养，取第3～7代细胞用于构建；所述培养液I，为DMEM含有谷氨酰胺2～10mM、孕酮10～20nM、丁二胺30～60μM、硒酸钠15～30nM、转铁蛋白65～100ng/ml；培养液II为10％胎牛血清+90％DMEM；消化液为含有0.25％胰酶和0.02％EDTA的PBS溶液；所述培养液Ⅱ，为10％FBS+90％DMEM。步骤二、真皮层构建取第5～10代成纤维细胞，每毫升培养液Ⅲ含0.5×106～3×106个成纤维细胞，置于5％CO2、37℃条件下培养2～3小时；加入培养液Ⅳ,每隔22～26小时更换培养液Ⅳ一次，共培养12～14天；所述培养液Ⅲ，是在DMEM培养液中添加体积比9:1的FBS，添加50～100mg/L的维生素C；所述培养液Ⅳ，为体积比75％DMEM+25％DMEM/F12，添加NaHCO3为3～5mg/ml，孕酮30～50nM，丁二胺30～60μM，硒酸钠10～20nM，50～100mg/L的维生素C，胰岛素15～30ng/ml，胎牛血清3～10％，氢化可的松150～180ng/L，腺嘌呤55～75μg/ml，碱性成纤维细胞生长因子8～12ng/ml，转铁蛋白10～20ng/ml，血管生长因子5～10ng/ml；步骤三、表皮层构建将培养液Ⅳ吸弃，将准备好的第3～7代表皮细胞按0.1×105～1.5×105个/cm2接种于真皮层表面，加入培养液Ⅴ‑SK1培养；置于5％CO2、37℃孵箱培养，每隔22～26小时换液一次，共培养48小时，得到双层皮肤；其中，培养液Ⅴ‑SK1:培养液Ⅳ+表皮生长因子(0.6～2ng/ml)+KGF(0.5～5ng/ml)+GM‑CSF(2.5～10ng/ml)；步骤四、全层皮肤的培养将制备的全层皮肤取出，放在培养支架表面，加入培养液Ⅴ‑SK1进行气液面培养；培养48h后更换为培养液Ⅴ‑SK2，进行气液面培养；培养48h后更换为培养液Ⅴ‑SK3，液面与皮肤表面平齐；培养48h后更换为培养液Ⅴ‑SK4，液面与培养支架平齐，继续培养至结束；培养液Ⅴ‑SK2:培养液Ⅳ+氯化钙(15～30μg/ml)+维生素C(50～100μg/ml)+表皮细胞生长因子(20～25ng/ml)；培养液Ⅴ‑SK3:培养液Ⅳ+氯化钙(150～200μg/ml)+维生素C(50～100μg/ml)+表皮细胞生长因子(20～30ng/ml)；培养液Ⅴ‑SK4:培养液Ⅳ+氯化钙(1～20mg/ml)+表皮细胞生长因子(10～35ng/ml)。