[发明专利]一种全层皮肤模型的构建方法

权利要求书

1.一种全层皮肤模型的构建方法，其特征在于：该全层皮肤模型无外源材料支架，具有成纤维细胞组成的真皮层和表皮细胞组成的表皮层；

其构建方法，包括以下方法步骤：

步骤一、成纤维细胞和表皮细胞的分离培养

成纤维细胞分离培养：将已去除脂肪和结缔组织的1mm³的皮肤组织，置于含有胶原酶200U·ml^-1、透明质酸300U·ml^-1的培养液I中，放置4℃过夜；再加入等体积的消化液，37℃空气摇床180rpm 20min后终止消化；1000rpm离心10min收集细胞；用含培养液Ⅱ调整细胞密度每毫升2×10⁵～4×10⁵细胞接种，5％CO₂、37℃条件下培养；

表皮细胞的分离培养：将表皮组织浸没于1.2U/mL的消化液中，置入4℃条件下16～20h；在无菌条件下撕下表皮层，将表皮层放入37℃预热的消化液中，在37℃条件下，消化10min后终止：每2min震荡3下；无菌200目筛网过滤，800r/min离心6min后弃上清；加入37℃预热的PBS缓冲液，吹打至均匀后，再次800r/min离心6min后，弃上清：加入I培养液，吹打至均匀；按照3×10⁴～5×10⁴/cm²的密度接种，移入5％CO₂、37℃条件下培养，取第3～7代细胞用于构建；

所述培养液I，为DMEM含有谷氨酰胺2～10mM、孕酮10～20nM、丁二胺30～60μM、硒酸钠15～30nM、转铁蛋白65～100ng/ml；培养液II为10％胎牛血清+90％DMEM；消化液为含有0.25％胰酶和0.02％EDTA的PBS溶液；

所述培养液Ⅱ，为10％FBS+90％DMEM。

步骤二、真皮层构建

取第5～10代成纤维细胞，每毫升培养液Ⅲ含0.5×10⁶～3×10⁶个成纤维细胞，置于5％CO₂、37℃条件下培养2～3小时；加入培养液Ⅳ,每隔22～26小时更换培养液Ⅳ一次，共培养12～14天；

所述培养液Ⅲ，是在DMEM培养液中添加体积比9:1的FBS，添加50～100mg/L的维生素C；

所述培养液Ⅳ，为体积比75％DMEM+25％DMEM/F12，添加NaHCO₃为3～5mg/ml，孕酮30～50nM，丁二胺30～60μM，硒酸钠10～20nM，50～100mg/L的维生素C，胰岛素15～30ng/ml，胎牛血清3～10％，氢化可的松150～180ng/L，腺嘌呤55～75μg/ml，碱性成纤维细胞生长因子8～12ng/ml，转铁蛋白10～20ng/ml，血管生长因子5～10ng/ml；

步骤三、表皮层构建

将培养液Ⅳ吸弃，将准备好的第3～7代表皮细胞按0.1×10⁵～1.5×10⁵个/cm²接种于真皮层表面，加入培养液Ⅴ-SK1培养；置于5％CO₂、37℃孵箱培养，每隔22～26小时换液一次，共培养48小时，得到双层皮肤；

其中，培养液Ⅴ-SK1:培养液Ⅳ+表皮生长因子(0.6～2ng/ml)+KGF(0.5～5ng/ml)+GM-CSF(2.5～10ng/ml)；

步骤四、全层皮肤的培养

将制备的全层皮肤取出，放在培养支架表面，加入培养液Ⅴ-SK1进行气液面培养；培养48h后更换为培养液Ⅴ-SK2，进行气液面培养；培养48h后更换为培养液Ⅴ-SK3，液面与皮肤表面平齐；培养48h后更换为培养液Ⅴ-SK4，液面与培养支架平齐，继续培养至结束；

培养液Ⅴ-SK2:培养液Ⅳ+氯化钙(15～30μg/ml)+维生素C(50～100μg/ml)+表皮细胞生长因子(20～25ng/ml)；

培养液Ⅴ-SK3:培养液Ⅳ+氯化钙(150～200μg/ml)+维生素C(50～100μg/ml)+表皮细胞生长因子(20～30ng/ml)；

培养液Ⅴ-SK4:培养液Ⅳ+氯化钙(1～20mg/ml)+表皮细胞生长因子(10～35ng/ml)。

2.根据权利要求1所述全层皮肤模型的构建方法，其特征在于：步骤一的表皮细胞的分离培养中,所述消化液含有0.25％胰酶和0.02％EDTA的PBS。

3.根据权利要求1所述全层皮肤模型的构建方法，其特征在于：步骤四中的培养条件，均为37℃，5％CO₂环境。