[发明专利]一种全层皮肤模型的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于组织工程学医用生物材料技术领域，具体涉及一种可替代皮肤进行化妆品、小分子化合物、活性蛋白、医疗器械、化学品、一次性卫生用品等产品的安全性与功效检测及其他与皮肤接触的材料的安全性与功效性评价的全层皮肤模型的构建方法。

背景技术

皮肤模型是指利用工程学和细胞生物学的原理和方法，在体外人工制备的皮肤替代品。全层皮肤模型与正常皮肤结构高度类似，具有完整的表皮层和真皮层结构，除可用来修复、替代缺损的皮肤组织外，其最大的用途在于替代人体皮肤组织进行化妆品、小分子化合物、活性蛋白、医疗器械、化学品、一次性卫生用品、与皮肤接触材料的安全性与功效性评价。

真皮层的体外构建技术是全层皮肤模型开发的关键。目前，主要有两种类型的技术：一种是应用材料学和生物工程学原理构建的真皮替代物，该类体外构建技术不利于细胞生长，难以实现替代真皮组织进行细胞功能的检测与评价。另一类是应用细胞复合材料培养的方法，比如以胶原等天然材料为支架，复合成纤维细胞构建成真皮层，并于其上接种表皮细胞，进一步构建成全层皮肤结构(如专利CN101062429、CN103041453A)。但此法获得的人工皮肤无法完全替代皮肤组织进行化妆品、小分子化合物、活性蛋白、医疗器械、化学品、皮肤接触性材料等的测试评价要求。用支架材料和活细胞构建的皮肤模型在培养过程中伴随着活细胞自身胶原的分泌以及支架材料的降解，导致人工皮肤组织收缩现象，严重影响全层皮肤模型体外构建中的传质效率，造成边缘收缩与培养器皿壁的分离，同时真表皮层之间不能形成与天然皮肤一致的基底膜结构，均对体外测试结果有影响。

目前尚未有不采用支架材料，仅依靠细胞自身分泌的细胞外基质构建形成的真皮层结构以及由真皮层支持生发的表皮结构结合形成的全层皮肤结构。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是：构建一种全层皮肤模型，该皮肤模型不含外源支架材料，具有成纤维细胞及自分泌细胞外基质组成的真皮层和表皮细胞组成的表皮层，结构更接近人体皮肤结构，具有良好的力学性能、结构稳定性和细胞应答敏感性等特点，可应用于多种皮肤替代测试。

本发明的全层皮肤模型的体外构建方法，包括以下步骤：

步骤一、成纤维细胞和表皮细胞的分离培养

成纤维细胞分离培养：将已去除脂肪和结缔组织的1mm³的皮肤组织，置于含有胶原酶200U·ml^-1、透明质酸300U·ml^-1的培养液I中，放置4℃过夜；再加入等体积的消化液，37℃空气摇床180rpm 20min后终止消化；1000rpm离心10min收集细胞；用培养液Ⅱ调整细胞密度，每毫升2×10⁵～4×10⁵个/cm²细胞接种，5％CO₂、37℃条件下培养；

表皮细胞分离培养：将表皮组织浸没于1.2U/mL的消化液中，置入4℃条件下16～20h；在无菌条件下撕下表皮层，将表皮层放入37℃预热的消化液中，维持37℃消化10min后终止：每2min震荡3下；无菌200目筛网过滤，800r/min离心6min后弃上清；加入37℃预热的PBS缓冲液，吹打至均匀后，再次800r/min离心6min后，弃上清：加入培养液I，吹打至均匀；按照3×10⁴～5×10⁴个/cm²的密度接种，移入5％CO₂、37℃条件下培养，取第3～7代细胞用于构建。

其中培养液I为DMEM(sigma公司生产)，含有谷氨酰胺2～10mM、孕酮10～20nM、丁二胺30～60μM、硒酸钠15～30nM、转铁蛋白65～100ng/ml；培养液II为10％胎牛血清(FBS)+90％DMEM；消化液为含有0.25％胰酶和0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸盐缓冲液(PBS)。

步骤二、真皮层构建

取第5～10代成纤维细胞，按照每毫升培养液Ⅲ含0.5×10⁶～3×10⁶个成纤维细胞进行接种，置于5％CO₂、37℃条件下培养2～3小时，加入培养液Ⅳ培养；每隔22～26小时更换培养液Ⅳ一次，共培养12～14天。