[发明专利]实时荧光定量PCR方法鉴定转基因植物中T-DNA串联重复序列的拷贝数的方法

摘要

本发明公开了一种实时荧光定量PCR方法鉴定转基因植物中T‑DNA串联重复序列的拷贝数的方法，步骤包括：通过农杆菌介导的植物转化方法将含有筛选基因BAR的植物表达载体pSKI015连接上HMGA基因，转入到野生型Col‑4拟南芥中；使用两个参考质粒连接载体；将经过草甘膦筛选的转基因拟南芥的RNA进行提取，反转录获得cDNA作为检测的模板，分别使用草甘膦抗性基因和HMGA基因的定量引物进行实用定量PCR的方式检测突变体植物的拷贝数。本发明的有益效果在于可以有效屏蔽T‑DNA串联结构对识别转基因植物拷贝数的影响，而且定量PCR与Southern blot相比更加方便高效。

主权项

1.一种实时荧光定量PCR方法鉴定转基因植物中T‑DNA串联重复序列的拷贝数的方法，其特征在于，步骤包括：(1)通过农杆菌介导的植物转化方法将含有筛选基因BAR的植物表达载体pSKI015连接上HMGA基因，转入到野生型Col‑4拟南芥中，获得了300个独立转基因株系；(2)使用两个参考质粒，其序列为序列表中SEQ ID NO：1、2所示，该两个参考质粒都含有一个编码拟南芥高迁移率蛋白HMGA的内参基因，其中一个质粒是将HMGA基因与PSKI015载体上的BAR基因连接，另一个质粒是将HMGA基因与含有左边界LB和右边界RB的T‑DNA正向重复序列连接，分别形成TOPO_HMGA_BAR和TOPO_HMGA_LR两个参考质粒；将经过草甘膦筛选的转基因拟南芥的RNA进行提取，反转录获得cDNA作为检测的模板，分别使用草甘膦抗性基因和HMGA基因的定量引物进行实用定量PCR的方式检测突变体植物的拷贝数；计算公式：t代表目标T‑DNA基因，r代表HMGA基因Rt的公式：Rt＝(Fat×Fct)/Fbt2Fat，Fct，Fbt分表代表植物目标基因的荧光强度。