[发明专利]单一紫外光激发的评价昆明犬精子活性的荧光染色法

摘要

单一紫外光激发的评价昆明犬精子活性的荧光染色法，通过TCG洗精液的配制、精液洗涤、染色、显微镜检测四个步骤实现，本发明采用能被同一波长紫外光所激发的二种荧光染料对昆明犬精子进行荧光染色，不用切换光源就可准确地鉴别精子活性；而且由于这二种染料在激光激发后一种发红色荧光，另一种发蓝色荧光，故在检测活性同时还可引入发绿色荧光的染料进行精子顶体完整性的检测。本发明操作简单，结果准确，可信度高，可以用荧光显微镜或流式细胞仪对昆明犬精子活性及顶体完整性做出准确检测。

主权项

单一紫外光激发的评价昆明犬精子活性的荧光染色法，其特征在于，通过如下步骤实现：（1）缓冲液，亦即TCG洗精液的配制称取2.4 g Tris, 1.4 g 柠檬酸, 0.8 g葡萄糖, 0.06 g青霉素G钠盐以及0.1 g 硫酸链霉素加入Milli‑Q超纯水中混合，混合均匀后加Milli‑Q超纯水定容至100mL，调节pH至6.8，制成TCG洗精液；（2）精液洗涤将采集的新鲜精液2‑3mL转至灭菌的15ml离心管中，加入10ml水浴预热致37℃的 TCG洗精液，700g离心5min，弃上清，加10ml 37℃的TCG洗精液再离心洗涤一次，沉淀用适量TCG洗精液重悬，使精子浓度为30×10⁶个/mL；（3）染色取1ml清洗后的精液，分别加入2μL H342和8μL PI，37℃温浴15min；（4）显微镜检测取8μL精液于载玻片上，盖上盖玻片，在荧光显微镜下检测并计数。