[发明专利]一种培养MDCK细胞增殖重组H5N1亚型禽流感病毒的方法

摘要

本发明提供了一种培养MDCK细胞增殖重组H5N1亚型禽流感病毒的方法，其步骤为片状载体的准备；纸片载体预处理；生物反应器灭菌及预培养；细胞接种及在纸片载体上的吸附；细胞连续培养；禽流感病毒接种；病毒液收获。本发明有益效果为是载体成本较低，获得的病毒液血凝价(HA)高，采用纸片载体进行生物反应器规模化培养MDCK细胞增殖重组H5N1亚型禽流感病毒更容易实现大规模培养、生产线占用空间小、生产效率高、所采用的设备、稳定性强、重复性好等优点。

主权项

一种培养MDCK细胞增殖重组H5N1亚型禽流感病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)片状载体的准备：所述载体可制备为a)将聚酯纤维纸片载体通过剪裁，做成长10cm，宽2cm的波浪形；b)将纸片载体通过剪裁，做成长10cm、宽2cm的长条形；c)将纸片载体通过剪裁，做成直径2cm的圆形；2)纸片载体预处理：将步骤1)得到的纸片载体用0.5mol/L‑1.5mol/L的氢氧化钠溶液浸泡12‑36h，然后用注射用水清洗至pH为6.8‑7.6，放掉注射用水，加入PBS液浸泡保存；3)生物反应器灭菌及预培养：将经过步骤2)处理的纸片载体按照15‑30g/L的使用量加入生物反应器内，再加入浸没纸片载体的PBS液，连接生物反应器所有管路后进行在线蒸汽灭菌：121℃，30min，灭菌完成后加入细胞培养液进行预培养12‑24h；4)细胞接种及在纸片载体上的吸附：将种子细胞以2×105‑2×107cells/g纸片载体的量通过无菌管道加入到纸片载体生物反应器内，将种子细胞载入生物反应器后调节培养参数，转速20‑40rpm、pH7.0‑7.4、温度37±0.2℃、DO 50％‑80％，有利于细胞在纸片载体上贴附；5)细胞连续培养：步骤4)得到的细胞在纸片载体吸附后进入正常连续培养状态，调整反应器培养参数为：转速60‑90rpm、温度37±0.2℃、pH7.0‑7.4、DO 30％‑70％；6)禽流感病毒接种：待步骤5)的细胞密度达到接种禽流感病毒的要求后，放掉反应器内的细胞培养液，加入禽流感病毒接种液和无血清维持液，调整反应器培养参数为：转速60‑90rpm、温度35℃‑37℃、pH7.0‑7.4、DO 30％‑70％，进行病毒增殖培养；7)病毒液收获：待步骤6)的病毒液达到所需效价后收获病毒液，经检测合格后作为制苗抗原液使用。