[发明专利]一种培养MDCK细胞增殖重组H5N1亚型禽流感病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种增殖禽流感病毒的方法，尤其是一种纸片载体生物反应器规模化培养MDCK细胞增殖禽流感病毒的方法。

背景技术

禽流感(Avian influenza,AI)是由A型禽流感病毒引起的一种禽类烈性传染病，被国际兽疫局定为A类传染病，我国也将之列为一类动物疾病。目前，疫苗免疫是国内外防治禽流感暴发的主要措施，我国目前大多数厂家以SPF鸡胚为基质生产禽流感疫苗，该工艺对SPF鸡胚有很大的依赖性；所产出的病毒液滴度不高；培养过程中条件不够均一，批间差异较大；由于鸡胚污染情况不可避免，致使疫苗内内毒素偏高，对免疫效果造成很大影响；同时鸡胚生产造成大量的鸡胚废弃物，对生态环境也是很大污染。

在生物反应器中用载体大规模培养动物细胞增殖禽流感病毒，已成为一种新的生产方式被推广应用，但目前多数厂家采用微载体进行病毒增殖，微载体多为美国GE公司生产，成本很高，同时由于每单位培养液中微载体的添加量限制，致使单位体积内细胞密度不高，从而无法获得高效价的抗原。而该工艺的发明不仅可以克服用鸡胚生产的弊端，同时又改变了生物反应器对微载体的依赖，使载体成本大大降低，最终获得高效价抗原液，进一步降低生产成本，对整个禽流感疫苗传统生产工艺有革命性的创新。

发明内容

为了解决用转瓶培养动物细胞增殖禽流感病毒过程中存在的问题，本发明提供了一种纸片载体生物反应器大规模培养MDCK细胞增殖重组H5N1亚型禽流感病毒的工艺方法。本发明所述的方法，可显著提高禽流感病毒液的滴度，减小批次间质量差异，减小染菌几率，控制内毒素含量，且该方法易于扩大生产规模，进行集约化生产，可用于显著提高疫苗的产量和质量。

本发明提供一种纸片载体生物反应器大规模培养MDCK细胞增殖重组H5N1亚型禽流感病毒的方法，其包括以下具体步骤：

1)片状载体的准备：所述片状载体可以为a)将聚酯纤维纸片载体通过剪裁，做成长10cm，宽2cm的波浪形；b)将纸片载体通过剪裁，做成长10cm、宽2cm的长条形；c)将纸片载体通过剪裁，做成直径2cm的圆形中的一种或几种。

2)纸片载体预处理：将步骤1)得到的纸片载体用0.5mol/L-1.5mol/L的氢氧化钠溶液浸泡12-36h，然后用注射用水清洗至pH为7.2-7.6，放掉注射用水，加入PBS液浸泡保存。

3)生物反应器灭菌及预培养：将经过步骤2)处理的纸片载体按照15-30g/L的使用量加入生物反应器内，加入浸没纸片载体的PBS液，连接生物反应器所有管路后进行在线蒸汽灭菌：121℃，30min，灭菌完成后加入细胞培养液进行预培养12-24h。

4)细胞接种及在纸片上的吸附：反应器预培养无异常后，将细胞密度为1×106-2×107cells/g纸片载体的细胞悬液通过无菌管道加入生物反应器内，调节电机转速为20-40rpm，有利于细胞贴附于纸片载体上。同时调节培养参数为：pH7.0-7.4、温度37±0.2℃、DO50％-80％，细胞在纸片载体上的贴附时间为3-6h。

5)细胞扩增培养：步骤4)的细胞在纸片载体贴附后进入正常连续培养状态，调整反应器培养参数为：转速60-90rpm、温度37±0.2℃、pH7.0-7.4、DO 30％-70％。因为纸片载体的表面积较大，扩增培养过程中，细胞数量会呈数量级倍增，所以培养过程中需要不定时取样，测定细胞生长液中的残葡萄糖浓度，计算细胞生长过程中的耗糖速率，根据细胞的耗糖速率来计算细胞的生长状况，及时补加葡萄糖或更换新鲜培养液。

6)禽流感病毒接种与繁殖：待步骤5)的细胞密度达到要求后，放掉反应器内的细胞培养液，通过无菌管道加入禽流感病毒接种液和无血清维持液，调整反应器培养参数为：转速60-90rpm、温度35℃-37℃、pH7.0-7.4、DO 30％-70％，进行病毒增殖培养。接种量按照总工作体积的1％-2％接种。

7)病毒液收获：待步骤6)接种禽流感病毒12h后，每隔6h取样，测定病毒液的HA效价，待其HA效价达到所需后收获，经检测合格后作为制苗抗原液使用。

本发明方法所得的禽流感病毒液HA滴度≥1:1024。

所述纸片载体为聚酯纤维类纸片载体。

其中，种子细胞的供应为：用转瓶扩增培养MDCK-α-2,3Gal细胞，挑选形态健康、生长良好的细胞用胰酶消化制成细胞悬液，并进行细胞计数，作为纸片载体生物反应器的种子细胞。

本发明的有益效果为：