[发明专利]一种培养MDCK细胞增殖重组H5N1亚型禽流感病毒的方法

权利要求书

1.一种培养MDCK细胞增殖重组H5N1亚型禽流感病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)片状载体的准备：所述载体可制备为a)将聚酯纤维纸片载体通过剪裁，做成长10cm，宽2cm的波浪形；b)将纸片载体通过剪裁，做成长10cm、宽2cm的长条形；c)将纸片载体通过剪裁，做成直径2cm的圆形；

2)纸片载体预处理：将步骤1)得到的纸片载体用0.5mol/L-1.5mol/L的氢氧化钠溶液浸泡12-36h，然后用注射用水清洗至pH为6.8-7.6，放掉注射用水，加入PBS液浸泡保存；

3)生物反应器灭菌及预培养：将经过步骤2)处理的纸片载体按照15-30g/L的使用量加入生物反应器内，再加入浸没纸片载体的PBS液，连接生物反应器所有管路后进行在线蒸汽灭菌：121℃，30min，灭菌完成后加入细胞培养液进行预培养12-24h；

4)细胞接种及在纸片载体上的吸附：将种子细胞以2×10⁵-2×10⁷cells/g纸片载体的量通过无菌管道加入到纸片载体生物反应器内，将种子细胞载入生物反应器后调节培养参数，转速20-40rpm、pH7.0-7.4、温度37±0.2℃、DO 50％-80％，有利于细胞在纸片载体上贴附；

5)细胞连续培养：步骤4)得到的细胞在纸片载体吸附后进入正常连续培养状态，调整反应器培养参数为：转速60-90rpm、温度37±0.2℃、pH7.0-7.4、DO 30％-70％；

6)禽流感病毒接种：待步骤5)的细胞密度达到接种禽流感病毒的要求后，放掉反应器内的细胞培养液，加入禽流感病毒接种液和无血清维持液，调整反应器培养参数为：转速60-90rpm、温度35℃-37℃、pH7.0-7.4、DO 30％-70％，进行病毒增殖培养；

7)病毒液收获：待步骤6)的病毒液达到所需效价后收获病毒液，经检测合格后作为制苗抗原液使用。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所得禽流感病毒液HA滴度≥1:1024。