[发明专利]一种石油降解菌固体菌剂的制备方法及由其制备的固体菌剂修复石油污染的土壤的方法

摘要

本发明涉及一种石油降解菌固体菌剂的制备方法，具体步骤如下：A、石油降解菌的筛选、驯化、B、制备种子培养液、C、固体菌剂的发酵、D、堆制产品干燥、粉化、计量、包装。本发明的有益效果是:本发明以非离子表面活性剂聚山梨酯‑80(土温80)作为增溶剂，能够提高石油的溶解效果。本发明专利所用固体发酵原料易得、工艺较简单，固体菌剂含有大量碳素及营养元素，为细菌生长提供更合适的基质，对微生物亲和力强，固定化效率高。提高所投加微生物与土著微生物的竞争力和降解效率。固体菌剂便于运输和农业操作，适用于石油污染土壤的大规模原位生物修复。

主权项

一种石油降解菌固体菌剂的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：A、石油降解菌的筛选、驯化1)菌源的采集取炼油厂常年被石油污染的土壤作为石油降解土著菌菌源。2)石油降解土著菌的初筛(1)取作为石油降解土著菌菌源的土壤样品，加入盛有无菌水的锥形瓶中，置于振荡培养箱中室温振荡0.5～2h，振荡频率为200rpm；(2)从步骤(1)的锥形瓶中取上清液，接入富集培养基，在温度30℃、转速175rpm摇床上振荡培养48h。取培养后的富集液涂布到筛选培养基平板上，30℃恒温培养48h。3)驯化用接种环挑取上述初筛得到的多株单一菌株在驯化培养基中进行接种驯化，具体步骤为：先用接种环挑取初筛得到的多株单一菌株分别接种到100mL驯化培养基A中，培养一个周期(在温度30℃、转速175rpm恒温振荡下培养7d为一个周期)，然后从驯化培养基A中取出10mL培养液加入到90mL的驯化培养基B中，培养一个周期。再从驯化培养基B中取出10mL培养液加入到90mL驯化培养基C中，培养一个周期。从驯化培养基C中取出10mL培养液加入到90mL驯化培养基D中，培养一个周期。从驯化培养基D中取出10mL培养液加入到90mL的驯化培养基E中，培养一个周期，从驯化培养基A到驯化培养基E，石油浓度梯度逐级升高。4)菌种的纯化(1)取驯化后的培养液，在含油平板上划线，30℃培养7d；(2)从含油平板上挑取单菌落转接LB斜面，30℃培养24h；(3)由LB斜面再次接种含油平板；(4)重复上述步骤，直至得到形态单一的纯化菌落；(5)纯化后的菌落接种于菌种保藏培养基斜面上，30℃培养24h后，保存于4℃冰箱中，备用。B、制备种子培养液将纯化得到的石油降解菌株分别单独接种在种子培养基中，经一级种子、二级种子、种子罐逐步扩大培养后，作为液体种子；液体种子的菌体密度达到1*10⁷cfu；其中：一级种子采用固态培养基斜面培养，培养条件为30℃，培养24小时；二级种子为液态培养基摇床培养，培养条件为30℃，转速175rpm，培养10‑12小时；种子罐培养条件为液体培养基搅拌培养，培养条件为30℃恒温，转速80rpm，通气量1:1。C、固体菌剂的发酵将经空气干燥后的废弃物生物质原料，粉碎或辗碎成1‑5mm的颗粒状；将生物质颗粒及其他配料装在耐高温的塑料袋中，110℃灭菌1小时待用；将种子罐中的种子培养液按照重量比10:1的固液比喷洒到堆料表面，将发酵种子培养液与固体发酵培养基均匀混合；将接种后的物料放到固体发酵床上在28‑30℃条件下进行增殖培养3‑5天，则制得微生物固定化材料；将步骤B中的一级种子液按比例1:10(v/w)接入处理好的固定化载体中，保持水分50‑55％，在28‑30℃条件下吸附、固定、增值3‑5天；按上述方法增值3次，即得固定化菌剂。D、堆制产品干燥、粉化、计量、包装将固定化菌剂在温度为40～60℃条件下干燥，至含水量为6～10％，将菌剂粉碎，过5mm筛。