[发明专利]一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒及其应用

摘要

本发明涉及医药生物技术领域，尤其是一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒及其应用技术。本发明设计的试剂盒包括以下两种组成PCR反应缓冲液、酶混合液、沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体/耐药性基因多重反应液；或PCR反应缓冲液、酶混合液、沙眼衣原体/解脲支原体/人型支原体多重反应液、耐药性基因反应液。本发明的试剂盒采用多重荧光定量PCR技术，能在同一PCR反应管中同时检测多个靶标基因，为同时检测病原体及其耐药性基因提供有力技术支撑。其方法具有对样本需要量少、成本低、操作简便、灵敏度高，特异性好的特点，具有极大的社会和经济意义。

主权项

一种病原体核酸及耐药性基因检测试剂盒，其特征是，该试剂盒包括以下各组组分：PCR 反应液、酶混合液、多重反应液；所述PCR 反应液包括10× 缓冲液、25mM MgCl2、10mM dUTP 和10mM dNTPs；所述酶混合液为包括Taq 酶和UNG 酶，所述的Taq 酶为热启动Taq 酶，所述的UNG酶为尿嘧啶‑N‑ 糖基化酶；所述多重反应液具体包括以下组分：组分（1）：由一对检测沙眼衣原体的引物和一条检测沙眼衣原体的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.2 和SEQ ID No.3 所示；探针的碱基序列为SEQ IDNo.1 所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；组分（2）：由一对检测解脲支原体的引物和一条检测解脲支原体的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.5 和SEQ ID No.6 所示；探针的碱基序列为SEQIDNo.4 所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；组分（3）：由一对检测人型支原体的引物和一条检测人型支原体的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.8 和SEQ ID No.9 所示；探针的碱基序列为SEQIDNo.7所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；组分（4）：由一对检测解脲支原体四环素类药物的耐药性基因的引物和一条检测解脲支原体四环素类药物的耐药性基因的探针组成；其中，两条引物的碱基序列分别为SEQ IDNo.10 和SEQ ID No.11 所示；探针的碱基序列为SEQ ID No.12 所示，该探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；上述人型支原体、解脲支原体、沙眼衣原体及解脲支原体四环素耐药基因的引物和探针的核苷酸序列如下：CT‑P       X1‑TCAATGCAACGGGTTATTCACTCCC‑Y1      SEQ ID No.1CT‑F       GCTTTTAACAACTTTCCAATCACT             SEQ ID No.2CT‑R       CAGTTCCTCCTAATAAAGTTTCAATG           SEQ ID No.3UU‑P       X2‑CGACTTTCTACATCTTCTCATGCGA‑Y2      SEQ ID No.4UU‑F       GCTAATACCGAATAATAACATCAAT            SEQ ID No.5UU‑R       CAACTATCTGATACGTCGCACC               SEQ ID No.6MH‑P       X3‑ACTGTTTAGCTCCTATTGCCAACGTATTG‑Y3  SEQ ID No.7MH‑F       ACTGTTTAGCTCCTATTGCCAACGTATTG        SEQ ID No.8MH‑R       GTTGTCATAAATCCTTTTTCAATACC           SEQ ID No.9UU‑TEL‑ P  GAACTGTATCCTAATGTGTG                 SEQ ID No.10UU‑TEL‑F   GATACTCTAACCGAATCTCG                 SEQ ID No.11UU‑TEL‑ R  X4‑GTTCTCGTTCCCTCTTTATCATGG‑Y4       SEQ ID No.12所述多重反应液每一组分的两条引物及一条探针的配比为：上游引物：下游引物：探针=6:4:2；所述试剂盒还包括有组分：阳性对照一和阴性对照；所述的阳性对照一包括以下组分：组分（1）：为含有部分沙眼衣原体的质粒pSotonE8 基因片段，大小为166bp，此基因片段核苷酸序列为SEQ ID No.13；组分（2）：为含有部分解脲支原体16S 核糖体RNA 基因片段，大小为164bp，此基因片段核苷酸序列为SEQ ID No.14 ；组分（3）：为含有部分人型支原体GAP 基因片段，大小为160bp，此基因片段核苷酸序列为SEQ ID No.15 ；组分（4）：为含有部分解脲支原体 四环素耐药Tn916 基因片段，大小为406bp，此基因片段核苷酸序列为SEQ ID No.16；所述的阴性对照为无菌水。