[发明专利]两步法检测葫芦科作物多种病毒的多重RT-PCR方法及其专用引物组

摘要

本发明涉及一种两步法检测葫芦科作物上6种病毒的多重RT-PCR方法及其专用引物，属植物保护领域。该方法包括第一步在一次PCR反应中检测葫芦科作物4种主要病毒(WMV、ZYMV、CMV、CGMMV)，第二步再在一次PCR反应中检测2种次要病毒(TMV和PRSV)。首先人工筛选合成适用于两步多重PCR的特异性引物；分析获得6种病毒单独侵染的病样，提取植株的总RNA；随机引物进行反转录，再分别整合4重和2重PCR的反应体系和条件，建立两步反应能够检测葫芦科作物上6种病毒的多重RT-PCR方法。本方法具有操作简便、省时省力、节约成本、结果可靠等优点，对葫芦科作物病毒病的监测监控具有广泛的应用前景。

主权项

两步法检测葫芦科作物上6种病毒的多重RT‑PCR方法及其专用引物，其特征在于：第一步在一次PCR反应中同时检测葫芦科作物中4种主要病毒(WMV、ZYMV、CMV、CGMMV)，第二步再在一次PCR反应中同时检测2种次要病毒(TMV和PRSV)，包括如下步骤：(1)甄别比对Genbank中收录的WMV、ZYMV、CMV、CGMMV、TMV和PRSV病毒各株系、各区域分离物全基因组序列确定相对保守区域，在选定的保守区域内使用Oligo5.0软件设计引物，并通过BLAST分析确保引物的特异性，筛选合成适用于两步多重RT‑PCR反应的引物6对，所述引物序列如下：WMV：上游引物(WMVF)5′‑CCAGTGGCAAAGGTGATA‑3′下游引物(WMVR)5′‑TGCTGCGTCTGAGAAATG‑3′ZYMV：上游引物(ZYMVF)5′‑AGCTCCATCATAGCTGAGCAG‑3′下游引物(ZYMVR)5′‑TAGCTTGCGCTTGCAAACGAC‑3′CMV：上游引物(CMVF)5′‑CACTATTCCCGACTTTGAGACCC‑3′下游引物(CMVR)5′‑CTCATAAGCGGCATACTCTAACAT‑3′CGMMV：上游引物(CGMMVF)5′‑CCACGAGTTGTTTCCTAATGCTG‑3′下游引物(CGMMVR)5′‑TTTGCTAGGCGTGATCGGATTGT‑3′TMV：上游引物(TMVF)5′‑TGGATCCGCCGACCCAATAGAGTTA‑3′下游引物(TMVR)5′‑GTCGAGGTCCAAACTAAACCAGAAG‑3′PRSV：上游引物(PRSVF)5′‑ATGAGGCTGTGGATGCTGGTTTA‑3′下游引物(PRSVR)5′‑GATTGAGTGGCACGAGTATTAGA‑3′(2)提取感染1‑6种病毒的葫芦科作物叶片的总RNA，再进行反转录，所述反转录反应体系如下：3μL RNA，1μL oligodT18(10μmol/L)，6μL DEPC水，65℃变性5min，迅速置冰上5min；再加入2.5μL5×RT buffer，0.5μL dNTP(各2.5mmol/L)，0.5μL RNase Inhibitor(40U/μL)和0.5μL M‑MLV反转录酶(200U/μL)，短暂离心后DEPC水补足至15μL，42℃水浴1h，70℃灭活5min，置‑20℃待用；(3)应用步骤(1)中合成的引物对反转录产物分别进行4重和2重PCR反应；(4)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，获得病毒基因扩增产物条带，判断侵染葫芦科作物的病毒种类。