[发明专利]一株产聚3-羟基丁酸酯的重组大肠杆菌及构建方法及用途

摘要

本发明公开了一株产聚3-羟基丁酸酯的重组大肠杆菌及构建方法及用途，方法为：将E.coli JM109的sdaA基因的启动子和核糖体结合位点序列置换为组成型启动子trc及RBS5；将设计的核糖体结合位点分别与基因pgk、serA、serB、serC连接成片段，与含启动子的转录调控序列Trc-162组成操纵子PSer，整合到基因组serC基因58bp位点；进而在编码丙酮酸脱氢酶复合体aceEF操纵子基因上游48bp插入转录调控序列Trc-162，构建工程菌株SD06。本发明所构建的菌遗传背景清晰，更有效获取乙酰辅酶A，在基本盐培养基中以葡萄糖为底物时聚三羟基丁酸酯的产量提高到野生菌的2.66倍。

主权项

一株产聚3‑羟基丁酸酯的重组大肠杆菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：(1)设计以SEQ ID NO.1所示的代号为RBS5的核糖体结合位点，将Escherichia coli JM109的sdaA基因的启动子和核糖体结合位点序列置换为以SEQ ID NO.33所示的组成型启动子trc及RBS5，构建工程菌株SD01；(2)设计以SEQ ID NO.2所示的核糖体结合位点RBS1、以SEQ ID NO.3所示的核糖体结合位点RBS2、以SEQ ID NO.4所示的核糖体结合位点RBS3和以SEQ ID NO.5所示的核糖体结合位点RBS4；(3)将RBS1和SEQ ID NO.36所示的基因pgk编码序列连接成片段1、将RBS2和SEQ ID NO.37所示的基因serA编码序列连接成片段2、将RBS3和SEQ ID NO.38所示的基因serB编码序列连接成片段3、将RBS4和SEQ ID NO.39所示的基因serC编码序列连接成片段4；(4)将片段1、片段2、片段3和片段4通过重叠‑延伸PCR融合为操纵子PSer，与SEQ ID NO.32所示的含启动子的转录调控序列Trc‑162一同整合到步骤(1)获得的工程菌株SD01的基因组serC基因‑58bp位点，得到工程菌株SD02；(5)在菌株SD02的编码丙酮酸脱氢酶复合体aceEF操纵子基因上游48bp插入SEQ ID NO.32所示序列，构建工程菌株SD06；(6)将含有PHB合成途径基因的质粒pBHR68导入SD06，得到基因型为E.coli JM109,Ptrc‑RBS5‑sdaA,Trc‑162‑RBS1‑pgk‑RBS2‑serA‑RBS3‑serB‑RBS4‑serC,Trc‑162‑aceEF,pBHR68,ampr，简称为含pBHR68E.coli SD06的产聚3‑羟基丁酸酯的重组大肠杆菌。