[发明专利]一株产聚3-羟基丁酸酯的重组大肠杆菌及构建方法及用途

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术与应用领域，具体地涉及一株产聚3-羟基丁酸酯的重组大肠杆菌及构建方法及用途。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一类广泛存在于微生物细胞内的高分子生物聚酯,作为碳源和能源的储备,具有完全的生物相容性及生物可降解性，具有部分替代石油化工产品的潜力。而聚-3-羟基丁酸酯(PHB)是其中一种得到最普遍研究的一类短链单体聚合物，在很多领域有着广泛的应用前景。PHB具有不溶于水，防潮，光学纯度高以及良好的氧渗透性等优点。

大多数天然的PHB生产菌(包括Ralstonia eutropha,Pseudomonas putida,Aeromonas hydrophila等)中，PHB的合成由三个连续的酶促反应步骤组成，首先由β-酮基硫解酶PhaA催化2个乙酰辅酶A缩合形成乙酰乙酰辅酶A，进而在NADPH依赖型乙酰乙酰辅酶A还原酶PhaB的催化下还原为(R)-3-羟基丁酰辅酶A，最后由PHA合酶PhaC催化其聚合成PHB。大肠杆菌作为工业生物技术研究最广泛的微生物，本身并不具备PHB的合成途径。但当引入异源PHB合成途径后，重组大肠杆菌由于生长快速，可利用多种廉价碳源和具有完全清晰的遗传操作体系，已作为一种良好的PHB生产菌被得到广泛的应用。且大肠杆菌不具备PHA降解酶，聚酯的积累水平较高，易破壁，有利于产品的分离提纯。

目前，利用基因工程方法对产PHB大肠杆菌的改造策略主要包括增加PHB合成前体乙酰辅酶A和辅因子NADPH在胞内的富集度以及优化PHB的合成途径。针对通过增加乙酰辅酶A的胞内富集度来提高大肠杆菌PHB生产力的基因工程改造主要集中于改造糖酵解途径及减少乙酰辅酶A衍生的副产物以及竞争途径的表达。

大肠杆菌作为一种重要的模式菌株，对其生理生化特性及遗传背景已经有了比较深入的了解，相关的分子生物学方法和基因操作技术都比较成熟，有利于通过代谢工程及合成生物学的合理设计来改进菌种。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一株产聚-3-羟基丁酸酯的重组大肠杆菌。

本发明的第二个目的是提供的一株产聚-3-羟基丁酸酯的重组大肠杆菌构建方法。

本发明的第三个目的是提供一株产聚-3-羟基丁酸酯的重组大肠杆菌的用途。

一株产聚3-羟基丁酸酯的重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)设计以SEQ ID NO.1所示的代号为RBS5的核糖体结合位点，将Escherichia coli JM109的sdaA基因的启动子和核糖体结合位点序列置换为以SEQ ID NO.33所示的组成型启动子trc及RBS5，构建工程菌株SD01；

(2)设计以SEQ ID NO.2所示的核糖体结合位点RBS1、以SEQ ID NO.3所示的核糖体结合位点RBS2、以SEQ ID NO.4所示的核糖体结合位点RBS3和以SEQ ID NO.5所示的核糖体结合位点RBS4；

(3)将RBS1和SEQ ID NO.36所示的基因pgk编码序列连接成片段1、将RBS2和SEQ ID NO.37所示的基因serA编码序列连接成片段2、将RBS3和SEQ ID NO.38所示的基因serB编码序列连接成片段3、将RBS4和SEQ ID NO.39所示的基因serC编码序列连接成片段4；

(4)将片段1、片段2、片段3和片段4通过重叠-延伸PCR融合为操纵子PSer，与SEQ ID NO.32所示的含启动子的转录调控序列Trc-162一同整合到步骤(1)获得的工程菌株SD01的基因组serC基因-58bp位点，得到工程菌株SD02；

(5)在菌株SD02的编码丙酮酸脱氢酶复合体aceEF操纵子基因上游48bp插入SEQ ID NO.32所示序列，构建工程菌株SD06；

(6)将含有PHB合成途径基因的质粒pBHR68导入SD06，得到基因型为E.coli JM109,Ptrc-RBS5-sdaA,Trc-162-RBS1-pgk-RBS2-serA-RBS3-serB-RBS4-serC,Trc-162-aceEF,pBHR68,amp^r，简称为含pBHR68E.coli SD06的产聚3-羟基丁酸酯的重组大肠杆菌。

上述方法构建的一株产聚3-羟基丁酸酯的重组大肠杆菌。