[发明专利]复制型重组人55型腺病毒载体及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种复制型重组人55型腺病毒载体及其制备方法和应用。所述复制型重组人55型腺病毒载体是以同源重组技术将人55型腺病毒基因组环化，以同源重组及双抗性筛选技术敲除Ad55的E3基因，且可以整合入外源基因表达框，将E3基因缺失的Ad55载体质粒线性化后，转染哺乳动物细胞可成功拯救并大量生产，进一步经密度梯度离心得到纯化的重组Ad55载体，以该载体携带外源基因可在靶细胞内实现高效表达，且外源报告基因的活性可反映病毒的生长特性。本发明基于人Ad55的复制型载体可潜在地应用于：抗人55型腺病毒疫苗研发；抗人55型腺病毒药物及中和抗体筛选；抗其他病原体疫苗的研发；生物学研究的报告示踪系统等。

主权项

1.一种复制型重组人55型腺病毒载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)以Ad55基因组为模板，分别扩增基因组两端反向重复序列作为同源重组臂L和R，并连接至氨苄抗性载体，线性化后与人55型腺病毒基因组在大肠杆菌中同源重组，得到环化的基因组质粒A；(2)以Ad55基因组为模板，扩增E3基因两端序列并反向连接至卡那抗性载体，线性化后与线性化的步骤(1)所述基因组质粒A重组，再经氨苄/卡那双抗筛选，得到去除E3基因的基因组质粒B；(3)以Ad55基因组为模板，进行PCR扩增，得到E3区上下游同源重组臂L‑delK及R‑delK；L‑delK以SpeI+EcoRI双酶切后连接至SpeI+EcoRI双酶切的pVax载体得到pVax‑L‑delK；R‑delK以EcoRV+XbaI双酶切后连接至EcoRV+XbaI双酶切的pVax‑L‑delK得到敲除Kana基因的穿梭质粒pVax‑delK(L+R)；pVax‑delK(L+R)质粒以SpeI+XbaI酶切，回收delK(L+R)片段；pAd55ΔE3‑Kana以SwaI线性化；delK(L+R)片段和线性化的pAd55ΔE3‑Kana共转染感受态细胞，同源重组得到去除Kana基因的pAd55ΔE3质粒；并整合入唯一酶切位点，线性化后转染哺乳动物细胞，密度梯度离心得到纯化的复制型重组人55型腺病毒载体。