[发明专利]复制型重组人55型腺病毒载体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种复制型重组人55型腺病毒载体及其制备方法和应用。所述复制型重组人55型腺病毒载体是以同源重组技术将人55型腺病毒基因组环化，以同源重组及双抗性筛选技术敲除Ad55的E3基因，且可以整合入外源基因表达框，将E3基因缺失的Ad55载体质粒线性化后，转染哺乳动物细胞可成功拯救并大量生产，进一步经密度梯度离心得到纯化的重组Ad55载体，以该载体携带外源基因可在靶细胞内实现高效表达，且外源报告基因的活性可反映病毒的生长特性。本发明基于人Ad55的复制型载体可潜在地应用于：抗人55型腺病毒疫苗研发；抗人55型腺病毒药物及中和抗体筛选；抗其他病原体疫苗的研发；生物学研究的报告示踪系统等。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是涉及一种复制型重组人55型腺病毒载体及其制备方法和应用。

背景技术

腺病毒是一类无包膜的双链DNA病毒，其基因组约35-40kb，已知人腺病毒共7个亚群(A-G)，60多个血清型，其中3、4、7、14型感染可导致急性呼吸道疾病甚至致死性肺炎。近年来，出现了由人11型与14型腺病毒重组产生的55型腺病毒(以下简称Ad55)，因人群普遍缺乏针对这种病毒的免疫力，很容易引起呼吸道传染病疫情，尤其是入伍新兵、寄宿制学校、托幼机构等在封闭环境中生活的群体。目前，尚无针对腺病毒感染的特效治疗药物，亦无可在普通人群中使用的腺病毒疫苗。因此，构建基于Ad55病毒的复制型报告病毒，对于研发抗人55型腺病毒的疫苗、药物及中和抗体至关重要。

同时，由于Ad55尚未大规模流行，人群中针对Ad55的中和抗体阳性率较低。因此，基于Ad55的基因载体可潜在的携带抗原基因或治疗性基因在普通人群中使用。腺病毒载体具有一系列优势，包括：1.安全性，腺病毒遗传背景相对清楚，基因组不整合至宿主染色体因而不会导致插入突变，删除其E1或E3基因可进一步降低腺病毒的致病力；2.有效性，腺病毒可高效感染分裂期及静息期细胞，携带的外源基因可长期高水平表达，具备较大的容纳外源基因的能力；3.生产工艺成熟，腺病毒可在宿主细胞中复制增长到很高的滴度因而容易大规模生产，理化性状稳定因而可方便地运输、储存等。因此，腺病毒载体已广泛用作基因表达载体、重组疫苗载体和基因治疗载体等，全球范围内已有数百项临床试验以腺病毒作为基因载体，居各类载体之首(24.8％)。我国具自主知识产权的基因治疗药物今又生(重组人p53腺病毒注射液)，即使用复制缺陷型的人5型腺病毒载体。

然而，多数人体内由于既往腺病毒感染而产生一定水平的抗腺病毒免疫反应，包括抗腺病毒中和抗体和杀伤性T细胞(CTL)。研究表明非洲和南美等发展中国家和地区的人群中Ad2、Ad5中和抗体阳性率很高，甚至超过90％。我们的研究也表明广东地区人群中Ad5中和抗体阳性率高达75％。这些中和抗体会抑制腺病毒载体产品进入机体细胞，使其难以行使免疫或治疗功能。此外，针对腺病毒载体的CTL反应亦可杀死靶细胞而抑制治疗性基因的持续表达。

为克服预存抗腺病毒免疫反应，研究者已开发一系列技术：

1)采用免疫抑制剂如环孢霉素、环磷酰胺、FK506等抑制抗腺病毒免疫反应。但是免疫抑制剂不具有特异性，往往带来显著的毒副作用，尤其是在免疫缺陷的人群。

2)修饰或改造腺病毒载体表面蛋白，绕开预存中和抗体。腺病毒表面蛋白经修饰或改造之后，掩盖其中和表位，从而可有效的进入靶细胞发挥生物学功能。但是，包裹的腺病毒粒子在细胞内释放效率被削弱，而改造表面蛋白的腺病毒载体使用一次即可产生新的抗载体免疫反应，不能重复使用。

3)以腺病毒体外感染PBMC然后自体回输的AVIP技术。PBMC分离并清洗之后，可经离心感染技术高效感染腺病毒载体。该技术可有效应用于经血液途径免疫或输送治疗性基因，但其应用范围有限。

4)采用在人群中流行率较低的稀有血清型腺病毒作为载体。人群中针对稀有血清型腺病毒的预存免疫反应往往较低，因而这些载体在临床中具有极大的应用潜力。