[发明专利]一种转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法

摘要

本发明公开了一种转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，构建iaaM基因在黄花蒿腺毛细胞特异表达的载体，利用根癌农杆菌介导法转化黄花蒿，获得经PCR检测的转基因黄花蒿植株。对转基因黄花蒿植株进行PCR基因扩增检测，并对转基因黄花蒿腺毛发育细胞情况及青蒿素含量进行观察与分析，筛选青蒿素含量显著提高的转基因黄花蒿植株，通过组织培养繁殖建立转基因高青蒿素含量的黄花蒿品系。本发明获得的转基因黄花蒿中青蒿素含量显著提高，最高可达非转化黄花蒿含量的1.5倍，本发明对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。

主权项

一种转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、构建iaaM基因在黄花蒿腺毛细胞特异表达的载体：将iaaM基因与Gl2基因启动子重组，克隆到Ti质粒的T‑DNA区pBI121质粒的HindIII及PstI位点，以NPT‑II基因为选择标记基因，载体以pBI121作为出发载体进行改造和载体构建，获得pBI121‑Gl2‑iaaM的重组Ti质粒，提取重组Ti质粒做PCR检测和酶切验证；步骤2、工程化根癌农杆菌菌株的制备：构建的重组Ti质粒通过电激转化法转化根癌农杆菌，转化后的根癌农杆菌经过筛选、培养至对数生长后期，所述的根癌农杆菌为LBA4404；步骤3、利用所构建的根癌农杆菌菌株转化黄花蒿，获得经PCR检测的转基因黄花蒿植株，具体包括以下步骤：1）外植体预培养：黄花蒿种子经消毒后在1/2MS培养基上发芽成苗，待苗长至4‑6cm时剪取黄花蒿幼苗子叶用于转化；2）黄花蒿幼苗子叶与根癌农杆菌的共培侵染转化：将黄花蒿幼苗子叶在培养至对数生长后期的根癌农杆菌液中侵泡30min；3）诱导愈伤组织：将共培侵染转化后的黄花蒿子叶以消毒后的MS培养液冲洗3遍，转接到MS+1% 6‑BA+0.05% NAA+30g/L 蔗糖+7g/L琼脂+500 mg/L羧苄青霉素+20 mg/L卡那霉素的MS1固体培养基上培养2d进行诱导抗性愈伤组织；4）抗性再生植株的筛选：抗性愈伤组织团生长至3‑4mm大小，取出叶盘采用无菌吸水纸吸干其表面多余水分，将叶盘平放到MS+1.5mg/L 6‑BA+0.05mg/L NAA+500mg/L羧苄青霉素+20mg/L卡那霉素的MS2培养基上诱导分化出芽，具体过程为愈伤组织稍微压入培养基，温度控制在22‑24℃之间，16h/8h进行光暗交替培养；28‑35d后诱导出抗性丛生芽，切下带芽愈伤部分，插入MS2培养基继续培养至茎分化和长高，待抗性芽生长至3‑5cm后，将其从愈伤组织基部切下，并将其移入1/2 MS+0.5mg/L NAA+0.5mg/L IAA+30 g/L蔗糖+7g/L琼脂的MS3生根培养基中诱导其生根，此时对每一颗阳性苗进行编号，温度控制在22‑24℃之间，16h/8h进行光暗交替培养；根诱导分化14d后，将分化苗移至消毒蛭石中，培养室内炼苗7d，然后移栽至营养土中生长得到转基因黄花蒿植株；步骤4、转基因黄花蒿植株的PCR检测和腺毛细胞发育观察：提取转基因黄花蒿植株叶片DNA，PCR法进行基因扩增检测，并对转基因黄花蒿腺毛发育细胞情况及青蒿素含量进行观察与分析；步骤5、建立转基因黄花蒿品系：筛选青蒿素含量显著提高的转基因黄花蒿植株，通过组织培养繁殖建立转基因高青蒿素含量的黄花蒿品系。