[发明专利]一种转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法

权利要求书

1.一种转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、构建iaaM基因在黄花蒿腺毛细胞特异表达的载体：将iaaM基因与Gl2基因启动子重组，克隆到Ti质粒的T-DNA区pBI121质粒的HindIII及PstI位点，以NPT-II基因为选择标记基因，载体以pBI121作为出发载体进行改造和载体构建，获得pBI121-Gl2-iaaM的重组Ti质粒，提取重组Ti质粒做PCR检测和酶切验证；

步骤2、工程化根癌农杆菌菌株的制备：构建的重组Ti质粒通过电激转化法转化根癌农杆菌，转化后的根癌农杆菌经过筛选、培养至对数生长后期，所述的根癌农杆菌为LBA4404；

步骤3、利用所构建的根癌农杆菌菌株转化黄花蒿，获得经PCR检测的转基因黄花蒿植株，具体包括以下步骤：

1）外植体预培养：黄花蒿种子经消毒后在1/2MS培养基上发芽成苗，待苗长至4-6cm时剪取黄花蒿幼苗子叶用于转化；

2）黄花蒿幼苗子叶与根癌农杆菌的共培侵染转化：将黄花蒿幼苗子叶在培养至对数生长后期的根癌农杆菌液中侵泡30min；

3）诱导愈伤组织：将共培侵染转化后的黄花蒿子叶以消毒后的MS培养液冲洗3遍，转接到MS+1% 6-BA+0.05% NAA+30g/L 蔗糖+7g/L琼脂+500 mg/L羧苄青霉素+20 mg/L卡那霉素的MS1固体培养基上培养2d进行诱导抗性愈伤组织；

4）抗性再生植株的筛选：抗性愈伤组织团生长至3-4mm大小，取出叶盘采用无菌吸水纸吸干其表面多余水分，将叶盘平放到MS+1.5mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+500mg/L羧苄青霉素+20mg/L卡那霉素的MS2培养基上诱导分化出芽，具体过程为愈伤组织稍微压入培养基，温度控制在22-24℃之间，16h/8h进行光暗交替培养；28-35d后诱导出抗性丛生芽，切下带芽愈伤部分，插入MS2培养基继续培养至茎分化和长高，待抗性芽生长至3-5cm后，将其从愈伤组织基部切下，并将其移入1/2 MS+0.5mg/L NAA+0.5mg/L IAA+30 g/L蔗糖+7g/L琼脂的MS3生根培养基中诱导其生根，此时对每一颗阳性苗进行编号，温度控制在22-24℃之间，16h/8h进行光暗交替培养；根诱导分化14d后，将分化苗移至消毒蛭石中，培养室内炼苗7d，然后移栽至营养土中生长得到转基因黄花蒿植株；

步骤4、转基因黄花蒿植株的PCR检测和腺毛细胞发育观察：提取转基因黄花蒿植株叶片DNA，PCR法进行基因扩增检测，并对转基因黄花蒿腺毛发育细胞情况及青蒿素含量进行观察与分析；

步骤5、建立转基因黄花蒿品系：筛选青蒿素含量显著提高的转基因黄花蒿植株，通过组织培养繁殖建立转基因高青蒿素含量的黄花蒿品系。

2.根据权利要求1所述的一种转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述步骤1中Gl2基因启动子获得途径为：从GenBank中的Nucleotide数据库中获得拟南芥Gl2基因核心序列，根据其核苷酸序列设计两条特异性引物，对拟南芥基因组DNA扩增，获得Gl2基因启动子。

3.根据权利要求1所述的一种转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述步骤2中电激转化法过程为制备的重组Ti质粒DNA 0.1 ug与1 mL感受态根癌农杆菌混合后置于电激杯，电激转化仪以细菌转化模式进行电激转化。

4.根据权利要求1所述的一种转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述步骤2中根癌农杆菌筛选与培养过程为将转化后的根癌农杆菌铺于含卡那霉素50 ug/mL和利福平20 ug/mL的YEB培养基上筛选，筛选得到的根癌农杆菌在YEB液体培养基28-30℃摇瓶培养过夜至对数生长后期，按1:10接种到扩大的培养体系继续摇瓶4 h。

5.根据权利要求1所述的一种转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述步骤4中转基因黄花蒿植株腺毛发育细胞情况及青蒿素含量观察与分析过程为取转基因黄花蒿幼嫩叶片，置于荧光体视显微镜下进行荧光显微观察，统计单位叶面积的腺毛细胞数，与对照非转基因黄花蒿比较，可以估测青蒿素含量提高情况。