[发明专利]冷冻原肠中微生物基因组DNA的提取方法

摘要

本发明公开了一种冷冻原肠中微生物基因组DNA的提取方法，在细胞裂解以前结合采用人工破碎、震荡洗脱、金属网过滤和梯度离心的方法同时对较多样品（10g）进行前处理。本发明既富集了细胞，解决了样品中微生物含量相对偏低的问题，也有效的去除了污染物的干扰，提高了DNA提取的效率和纯度。本发明具有较好的通用性，提取的冷冻原肠微生物基因组DNA的OD260/OD230及OD260/OD280接近标准值，可直接进行基因扩增和微生物多样性分析。

主权项

一种冷冻原肠中微生物基因组DNA的提取方法，其特征是：包括下列步骤:（1）常温解冻冷冻原肠样品，在超净工作台内用高压灭菌处理过的剪刀、镊子将原肠纵向剪开，再剪碎，搅拌混匀；（2）称取混匀后的样品10 g加入无菌的250 mL三角烧瓶，再向三角烧瓶加入10 mL含0.1% Tween80的灭菌生理盐水，密封三角烧瓶；（3）将三角烧瓶震荡1 min，然后立即置冰上2 min；重复本步骤3次；（4）在超净工作台内用高压灭菌处理过的100目金属滤网过滤样品，收集滤液；（5）将滤网中肠衣样品重新移回三角烧瓶，再向三角烧瓶加入10 mL含0.1% Tween80的灭菌生理盐水，密封三角烧瓶；重复步骤（3）～（4） 1次；（6）弃去肠衣样品，将两次收集的滤液合并混匀，分装至灭菌离心管中，4 ℃，400 rpm离心5 min；（7）转移上清至新的灭菌离心管中，4 ℃，8000 rpm离心5 min，弃去上清，在沉淀中并加入总体积为2 mL的灭菌超纯水；（8）重悬沉淀，4 ℃，12 000 rpm离心5 min，弃去上清，保留沉淀；重复本步骤1次；（9）在沉淀中加入总体积为800 μL的灭菌超纯水，重悬沉淀，分装入2个1.5 mL灭菌Eppendorf管中；（10）在2个Eppendorf管中分别加入与悬液等体积的酚、氯仿、异戊醇混合液，且体积比酚：氯仿：异戊醇为25:24:1，颠倒混匀6～10次，4 ℃，12 000 rpm离心10 min，小心将上清液分别转移至新的1.5 mL灭菌Eppendorf管中；重复本步骤1次；（11）将上述步骤（10）获得的上清液加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，‑20 ℃静置2 h，12 000 rpm离心10 min，弃去上清；（12）加入70% 乙醇600 μL洗涤沉淀，4 ℃，12 000 rpm离心5 min，弃去上清，保留沉淀，在室温下充分干燥后，用20～40 μL的TE缓冲液溶解沉淀，‑20 ℃保存备用。