[发明专利]一种评价臭氧破坏鱼类神经坏死病毒核酸链效果的方法

摘要

本发明提供一种评价臭氧破坏鱼类神经坏死病毒核酸链效果的方法，即在鱼类神经坏死病毒核酸链3′末端设计反转录引物P，在5′末端设计PCR引物对F/R。臭氧处理鱼类神经坏死病毒后，病毒核酸链3′端断裂则不能启动反转录，5′端或中间断裂虽能启动反转录但不能进行PCR扩增。因此，断裂的病毒核酸片段不能被扩增，只有完整的病毒核酸链才能得到扩增产物。发明的LR RT-PCR方法可以对完整的和断裂的病毒核酸链进行有效区分，从而可以用于评价臭氧对鱼类神经坏死病毒的杀灭效果。该LR RT-PCR方法可以快速、方便、可靠地评价臭氧对鱼类神经坏死病毒的破坏效果，适用于养殖企业和各级水生动物疫病防控部门对鱼类神经坏死病毒的检测和监控，具有很高的实用价值和应用前景。

主权项

一种评价臭氧破坏鱼类神经坏死病毒核酸链效果的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：1)臭氧消毒后的组织样品RNA的提取称取50～100mg消毒后的水产动物眼部或脑部组织，加入1ml RNAiso Plus试剂研磨，振荡混匀后室温静置5min；加入200μl的氯仿摇匀，室温静置5min；4℃、12000r/min离心15min，取上清液；加入等体积异丙醇，室温静置10min，4℃、12000r/min离心10min，弃上清液；沉淀中加入75％乙醇溶液洗涤，4℃、12000r/min离心5min，弃上清液，室温干燥；加入20μl DEPC处理水溶解、定量，备用；2)反转录合成cDNA在20μl的反转录体系中，含有0.05～5μg RNA样品，1～100pmol引物P，10μl2×反转录缓冲液，0.1～5μl逆转录酶，DEPC处理水补齐至20μl；将上述反应体系置于42℃30min，然后85℃5min，最后4℃保存备用；3)PCR扩增目标片段在25μl的PCR反应体系中，含：10×PCR Buffer2.5μL，4种dNTP混合物0.5～50nmol，Mg²⁺10～1000nmol，Taq酶0.1～10U，引物F和R各1～100pmol，cDNA模板0.1～10μL，DEPC处理水补足至25μL；将上述反应体系置于PCR仪上，运行下述程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，52～62℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；4)扩增结果的判定使用1～2％琼脂糖凝胶电泳观察PCR扩增产物；其中电泳结果存在352bp的特异性条带为鱼类神经坏死病毒阳性，臭氧消毒效果差；无特异性条带为鱼类神经坏死病毒阴性，臭氧消毒效果良好。